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RNA与RNA结合蛋白的相互作用实验

点击次数：  更新时间：2016/11/16 14:27:09  

实验方法原理: 大肠杆菌中异源性的 RNA-BP 与靶 RNA 的结合会抑制靶基因的翻译。此方法已成功地应用于包括 HIV Rcv 蛋白和核仁素（nucleolin）在内的多种 RNA-BP 的研究中。

实验材料: 质粒菌株

试剂、试剂盒: X-Gal 储液、IPTG 储存液、lacZ 缓冲液、ONPG 溶液、碳酸钠溶液、β-巯基乙醇、SDS、氯仿

仪器、耗材：检测指示板

实验步骤

―、材料与设备

 

1. 质粒：pREV1，pLacZ-Rep，pACYC184。

 

2. 菌株：WMI 和 WMI/F'。

 

3. X-Gal 储液：30 mg/ml X-Gal 以二甲基甲酰胺溶解，-20℃ 保存。

 

4. IPTG 储存液：1 mol/L IPTG 以水溶解，20℃ 保存。

 

5. lacZ 缓冲液：60 mmol/L Na2HPO4，40 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgSO4（pH 7.0）。

 

6. ONPG 溶液：4 mg/ml ONPG 溶解于水中，4℃ 保存。

 

7. 1 mol/L 碳酸钠溶液。

 

8. β-巯基乙醇。

 

9. SDS。

 

10. 氯仿。

 

11. 检测指示板：LB-琼脂板，含 100 μg/ml 氨芐青霉素，35 μg/ml 氯霉素，60 μg/ml X-Gal，和（或）IPTG。

 

12. 培养液：含 100 μg/ml 氨芐青霉素，35 μg/ml 氯霉素，和/或 IPTG 的 LB 培养液。

 

二、操作方法

 

1. 报道质粒 pLacZ-Rep 的构建

 

利用 PCR 将待研究的 RNA 靶分子序列克隆到质粒 pLacZ-Rcp。RNA 靶分子序列应尽量接近 SD 序列，使 RNA-BP 与靶 RNA 结合后产生最大的转录抑制效应。pLacZ-Rep 质粒中两个单一的限制酶位点 KpnⅠ 和 HindⅢ 可作为靶 RNA 分子序列的插入位点。

 

2. RNA-BP 表达质粒的构建（pREV1 )

 

质粒 pREV1 编码 HIV-1 Rev 蛋白，Rev 基因上游有 ClaⅠ和 NdeⅠ两个单一的限制酶位点，Rev 基因下游有 SalⅠ和 Bsu36Ⅰ两个单一的限制酶位点；利用这些酶切位点将 Rev 基因切除，换为 RNA-BP 的编码序列。质粒克隆过程中要注意读码框是否吻合，并 保证插入的 RNA-BP 编码序列中尽量不含用于克隆的限制酶识別位点；若实在避不开上述位点，也可以根据情况采用其他的限制酶进行替换。

 

3. 转录抑制的检测

 

将构建好的报道质粒和 RNA-BP 表达质粒共转化大肠杆菌 WM1/F'，涂布于 X-Gal 检测指示板，37℃ 培养过夜。表达 β-半乳糖苷酶时，细菌克隆呈现蓝色，而克隆颜色的深浅与 β-半乳糖苷酶的表达水平直接相关，可以很容易的区分 β-半乳糖甘酶活性相差一倍或一倍以上的克隆。通过报道质粒和 RNA-BP 表达质粒共转化的细菌克隆与报道质粒和对照质粒 pACYC184 共转化的细菌克隆之间的比较，就可以判定 lacZ 的表达是否被 RNA-BP 表达所抑制。蓝色明显减弱的克隆说明 RNA-BP 的表达引发了转录抑制。

 

在实验过程中需要确定 RNA-BP 表达的最佳条件，但应注意某些 RNA-BP 高水平的表达可能对菌株产生毒性。表达 RNA-BP 的质粒 pREV1 的启动子受 lac 抑制因子调节，因此在含有较高水平的 lac 抑制因子的菌株（如 WM1/F' ) 中，RNA-BP 的转录被抑制。这些菌株中可以在 lac 诱导试剂 IPTG 存在的情况下获得 RNA-BP 基因中等程度的转录。

 

(1) 观察转录抑制效应

 

① 将构建好的报道质粒和 RNA-BP 表达质粒共转化大肠杆菌菌株 WM1/F'，同时以报道质粒和对照质粒 pACYC184 共转化大肠杆菌菌株 WM1/F' 作为阴性对照。

 

② 将转化后的细菌分成小份，分别涂布含有 0 μmol/L，1 μmol/L，2 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，50 μmol/L 或 100 μmol/L IPTG 的 LB-琼脂检测指示板，37℃ 培养过夜。

 

③ 次日，比较不同转化株与对照转化株之间的颜色差别 ( 必须注意要在同样的 IPTG 浓度的板之间进行比较），确定能够明显观察到 RNA-BP 转化株与对照质粒转化株之间颜色差异的检测指示板的最低 IPTG 浓度。

 

(2) β-半乳糖苷酶活性检测

 

① 从上一反应中获得的可明显观察到 RNA-BP 转化株与对照转化株之间颜色差异的最低 IPTG 浓度检测指示板上挑取 4~6 个克隆至含氨苄青霉素、氯霉素和 IPTG 的 LB 培养液中，同时挑取对照菌株。37°C 振摇过夜。

 

② 接种 45 μl 过夜培养物至 1.5 ml 含氨苄青霉素、氯霉素和 IPTG 的 LB 培养液中，37℃ 振摇 1.5~2.0 h（OD600 约为 0.5）。

 

③ 将样品置于冰上 20 min。

 

④ 将样品倒入聚苯乙烯管，检测 OD600，以培养液做空白对照。

 

⑤ 准备几个玻璃试管，分别加入 0.5 ml lacZ 缓冲液，0.01% SDS 和 50 mmol/L β-巯基乙醇，各滴两滴氯仿，再在各管内分別加入 0.5 ml 细菌培养液。同样以培养液做空白对照。剧烈振摇 15 s，28℃ 水浴反应 5 min。

 

⑥ 在各管内加入 200 μl ONPG 溶液，开始计时；28°C 水浴反应直至管内液体变黄。

 

⑦ 加入 0.5 ml 1 mol/L 碳酸钠溶液，振摇终止反应，同时记录各管的反应时间。若 3~5 h 仍无明显颜色变化，也一样终止反应。将反应后的样品转入微量离心管，16000 g 离心 5 min，将上清转移到聚苯乙烯管，小心避免混入氯仿。

 

⑧ 读取 OD420，减去空白培养液管的数值。

 

⑨ 每个细菌培养样品的 β-半乳糖苷酶活性（miller unit ) = （2000 X OD420）/（△t X OD600），△t 表示 ONPG 水解反应的分钟数。

 

假设实验过程中误差极小，RNA-BP 的表达完全不影响细菌的生长，各个单独的克隆生长状态均很好，样本之间 β-半乳糖苷酶活性的变化也很小，这种情况下 RNA-BP 的抑制活性是可以定量的。因此，在任何 IPTG 浓度条件下，如果报道质粒和对照质粒共转 化的菌株中 β-半乳糖苷酶的平均活性为 X，报道质粒和 RNA-BP 表达质粒共转化的菌株中 β-半乳糖苷酶的平均活性为 Y，抑制率 R 就可以计算（R=X/Y)。抑制率体现的是大肠杆菌中 RNA-RP 与靶 RNA 结合后对翻译的抑制程度。在后面将要介绍的一些实验中，一般要求 RNA-BP 对报道蛋白表达的抑制最好达到 5 倍或 5 倍以上；若 R≤5，则应提高 IPTG 的浓度以表达更多的 RNA-BP。另一方面，如果在某一 IPTG 浓度下，各个表达 RNA-BP 的菌株之间 β-半乳糖苷酶活性的差异较明显，可能预示表达的 RNA-BP 对细菌产生了毒性，此时就需要降低培养时的 IPTG 的浓度。

 

一旦检测到 RNA-BP 对报道基因表达的抑制作用，就需要进一步确定这种抑制作用是由 RNA-BP 与靶 RNA 之间的特异性的结合所导致的，最简单的方法就是在 RNA-BP 编码序列或靶 RNA 中导入突变，这将会影响到二者的结合。

 

4. 大肠杆菌系统的应用

 

(1) 确定能够影响 RNA-BP 与靶 RNA 之间结合的突变

 

在检测到 RNA-BP 与靶 RNA 之间的特异性结合对报道基因表达的抑制作用后，此大肠杆菌系统就可以用来筛选影响 RNA-BP 与靶 RNA 之间亲和力的 RNA-BP 的突变位点了，这种筛选突变体方法是基于大肠杆菌中 RNA-BP 与靶 RNA 之间的亲和力与其对翻译的抑制作用相关之上的。因此在大肠杆菌中，能增强 RNA-BP 与靶 RNA 之间亲和力的 RNA-BP 突变体对 lacZ 合成的抑制作用比天然 RNA-BP 要强，而减弱 RNA-BP 与靶 RNA 之间亲和力的 RNA-BP 突变体对 lacZ 合成的抑制作用则比天然 RNA-BP 要 弱。通过观察转化菌株的颜色变化就可以从 RNA-BP 突变体库中筛选得到能增强或减弱 RMA-BP 与靶 RNA 之间亲和力的突变类型。

 

采用遗传学的方法可以对上述方法进行一些改变来研究 RNA-BP 与其靶 RNA 序列之间的相互作用，其中最为常用的是将 RNA-BP 进行不同的突变来研究这些突变对其与 RNA 结合及报道基因翻译抑制的影响。对 RNA-BP 进行全面的突变可以帮助研究者确定 RNA-BP 与 RNA 结合的表面（RNA biding surface )。如果对 RNA-BP 与靶 RNA 之间的结合知之甚少，最好的研究方法是对RNA-BP 进行随机突变，然后筛选影响报道基因 lacZ 合成的突变体，经过测序就可以确定哪些氨基酸的改变会影响 RNA-BP 与靶  RNA 之间的结合。如果知道哪些区域影响两者之间的结合，就可以缩小突变的范闱。在实验中，对突变频率也应加以控制，最好将整体突变频率保持在每个基因含有一个或一个以下的突变。突变频率过低会增加为筛选得到影响相互作用的突变株所需的筛选工作量，而突变频率过高会使结果分析变得复杂。

 

当仅仅需要对一小段区域进行突变时，最方便的方法就是合成一小段与要突变区域对应的寡核苷酸，然后将其整合到 RNA-BP 编码序列中。为方便此操作，pREV1 质粒中含有一个 f1 噬菌体复制起始位点，可以合成单链 DNA，这是一些进行寡核苷酸突变过程 中的中间体。当对大于 50 或 100 个碱基的较长的编码序列进行突变时，目前常用的方法是易错 PCR（error prone PCR）。

 

制备出突变体质粒库后，可以直接转化已预先转化有报道质粒的菌株；也可以先经过电转化感受态细菌，在菌体内扩增后再转化已转化有报道质粒的菌株。转化后的细菌涂布检测指示板，同时涂布野生型 RNA-BP 与报道质粒共转化的菌株作为对照，37℃ 培养过夜后挑取颜色与对照转化株不同的克隆。

 

尽管采用这种方法得到的不少阳性克隆中的 RNA-BP 同靶 RNA 间的亲和力发生了改变，但是有一部分阳性克隆中 lacZ 表型的变化并非 RNA-BP 同靶 RNA 间的亲和力改变所致，而是由于转化株中 RNA-BP 的表达量发生了改变。一种区分这两种导致细菌表型改变的原因的简单方法是分別制备对数生长期细菌（包括野生型 RNA-BP 与报道质粒共转化的对照菌株和表型发生了改变的待测菌株）的蛋白裂解液，经丙烯酰胺凝胶电泳，染色或 Western 印迹检测对 RNA-BP 的表达进行定量，筛除 RNA-BP 表达量明显改变的转化株。进一步的研究就可以集中在表型改变显著而 RNA-BP 的表达量无明显变化的转化株了。当无法直接观察到 RNA-BP 的表达水平时，也可以采用间接的方法通过对细菌生长的抑制程度来对 RNA-BP 的表达量进行判定。间接的检测方法是在不含 IPTG 的培养液中过夜培养野生型 RNA-BP 与报道质粒共转化的对照菌株和突变体 RNA-BP 与报道质粒共转化的待测菌株，将已达生长平台的过夜培养菌按 1：100 的比例分别接种（培养液中 IPTG 浓度略微抑制野牛型 RNA-BP 表达），37℃ 振摇  2~3 h，检测 OD600。与野生型 RNA-BP 与报道质粒共转化的对照菌株 OD6000 值一致的突变体转化本中的 RNA-BP 表达水平应该比较一致，而 OD600 值相差较远的转化株可以丢弃。

 

得到了一系列的表型改变的转化本后，需要通过 β-半乳糖苷酶活性检测来对结果进行进一步的确认。在进行进一步的分析之前，需要提取并纯化质粒 DNA，然后再转化含有报道质粒的菌株，继而进行 β-半乳糖苷酶活性检测。在这部分实验中，可以找到参与 RNA-BP 与靶 RNA 结合的氨基酸。

 

此外，通过与突变 RNA-BP 编码序列类似的方法即对靶 RNA 序列进行突变也同样可以为研究 RNA-BP 与靶 RNA 间的相互作用提供有意义的信息。在这一实验中，将突变好的报道基因质粒库转入含有野生型 RNA-BP 的菌株中，同样经过表型筛选和 β-半乳糖苷酶活性检测，最后筛选得到的是靶 RNA 中影响其与 RNA-BP 相互作用的核苷酸序列。

 

(2) 评估 RNA 突变体或 RNA-BP 突变体的结合亲和力

 

建立的大肠杆菌系统可以高水平的表达 RNA-BP 和低水平表达 lacZ 报道基因。简单的翻译抑制模型揭示：大肠杆菌中 RNA-BP 的翻泽抑制强度与 RNA-BP 和靶 RNA 之间的亲和力相关。这一假设通过采用纯化的蛋白和 RNA 来分析 RNA-BP Rev 和核仁素的不同突变体同靶 RNA 的解离常数对翻译抑制的影响得到了证实。研究人员分别构建了一系列 Rev 和核仁素的突变体，用 RNA 凝胶移位结合试验（gelshift RNA-binding assay）检测 RNA-BP 与靶 RNA 复合物的解离常数，同样的 RNA-BP 与靶 RNA 复合物在大肠杆菌系统中也进行了体内的抑制率（R）的检测。以解离常数 Kd 的对数对抑制率（R-1）的对数进行作图，Rev 和核仁素的突变体均得到吻合度很好的一 条直线（表明二者线性相关）。RNA-BP Rev 和核仁素的这种规律可能也适用于其他的 RNA-BP。此外，如果在构建了一系列的突变体后，选取其中的 6 至 8 个突变体进行纯化并采用胞外方法检测解离常数 Kd，采用胞内方法检测抑制率 R，绘出标准曲线；则若通过试验测得了其他突变体的抑制中，就可以利用标准曲线推算得到此突变体的解离常数 Kd 。