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蛋白质的定量测定实验

点击次数：  更新时间：2016/12/23 19:17:51  

蛋白质的定量测定实验

试剂、试剂盒 Bradford 试剂牛血清白蛋白 (BSA) 标准溶液Tris-缓冲盐溶液

仪器、耗材 微量滴定板、分光光度计或酶联仪

实验步骤

材料与设备

 

牛血清白蛋白 (BSA) 标准溶液 (2 mg/ml 水溶液）

 

Bradford 试剂（CoomassiePlus,PierceChemicalCo.)

 

分光光度计 (可在 595nm 处测量的) 或酶联仪 (带 595-nm 滤光片的)

 

微量滴定板（ImmulonTM2，Dynatech Laboratories,Inc.)

 

试剂

 

Tris-缓冲盐溶液（TBS)

 

操作程序

 

1) 用 TBS 配制成一系列稀释度的 BSA 标准溶液，BSA 含量分別为：2000、1000、500、250、125、62.5 和 31.25ug/ml。每个待测的未知样品亦用 TBS 配制成一组倍比稀释的样品液。

 

2) 各取 5ul BSA 稀释液和未知样品稀释液，分别加入 1 ml Bradford 试剂。混合后，室温孵育 5 min, 并在 1 h 内测 A595nm 值。如有酶联仪可用，测 A595nm 值则更为方便。用微量滴定板法时，各样品取 7ul 加入 200ul Bradford 试剂中，用加样器吸头混合，并保证微孔中无气泡存在。若有气泡，则可用一 22 号针头将气泡刺破。室温下孵育 5 min 后，测定 A595nm 值。

 

3) 可测两种对照。—是测定存在于样品中的各种缓冲液，看看它们本身是否会显色。二是在有不同缓冲液存在的条件下测定中间浓度范围的 BSA 标准，看看这些缓冲液是否干扰 BSA 的显色。

 

4) 作标准曲线，确定未知样品的蛋白浓度。

注：由于σ32 纯化过程中所甩的-些试剂（如:SKL、脱氧胆酸钠和聚乙烯亚胺对本法有一定干扰，为此，我们找到了一种可以仿效的微量方法，即用 0、5、10、15 和 25ug/ml BSA 及 100、200 和 400 倍稀释的制备物样品进行测定。在微量滴定板各孔中，先加 100ul Bradfod 试剂，再分别加入各稀释样品 100ul, 然后按上述步骤搡作。