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脂肪细胞的原代培养

点击次数：  更新时间：2016/12/26 19:04:44  

脂肪细胞的原代培养

 

实验材料 DMEM-A、DMEM-B、胶原蛋白酶、雄性 Sprague-Dawley 大鼠

试剂、试剂盒 KRBH缓冲液、KRBH-A缓冲液

仪器、耗材 Petri培养皿、锥形离心管、聚丙烯管、低密度聚丙烯瓶、尼龙滤网、尖解剖剪、Perry镊、塑料箱、铡刀、移液器

实验步骤

一、切除附睾脂肪垫

 

1. 在充有 70 % CO2 和 30 % O2 混合气体的塑料箱内麻醉大鼠（雄性 Sprague-Dawley 大鼠：145~170 g，CD 系（Charles River Breeding Laboratories）。

 

2. 用铡刀断头放血。

 

3. 将鼠体在 70 % 乙醇内浸泡一会儿。

 

4. 尽量在无菌条件下切除附睾脂肪垫。

 

(a)用一把解剖剪剖开下腹部皮肤，暴露腹膜。

 

(b)用另一把解剖剪剖开腹膜，然后用 Perry 镊向上牵拉睾丸。

 

(c)剪取附睾脂肪垫，注意保留血管。

 

5. 将组织移送到培养实验室。

 

脂肪细胞的胶原蛋白酶（在 2 ml KRBH 缓冲液加入 20 mg/ml 胶原蛋白酶，然后用 0.22 μm 滤器过滤）消化和洗涤

 

6. 将 4 g 脂肪垫（相当于 8 个附睾的脂肪垫）放入盛有 4 ml KRBH 缓冲液 （Krebs-Ringer 液，pH 7.4，添加 10 mmol/L NaHCO3、30 mmol/L HEPES（Sigma）、200 nmol/L 腺苷（Boche）和 1 % BSA （W / V，Intergen）。配制 1 L KRBH 缓冲液时，用 7 g NaCl、0.55 g KH2PO4、0.25 g MgSO4 7H2O、0.84 g NaHCO3、0.11 g CaCl2、7.15 g HEPES、10 g BSA、1 ml 200 μmol/L 腺苷， 加超净水至 1 L。然后，按 100 ml 分装。使用前加热至 37°C，并将 pH 调整至 7.4。）（37°C）的 30 ml 低密度聚丙烯瓶内。

 

7. 将脂肪垫剪成直径约为 2 mm 的组织块。

 

8. 将组织块放入瓶内，然后加入 1 ml 胶原蛋白酶液。在 37°C 水浴振荡器孵育约 1 h，直至细胞混合物形成乳脂样浓稠液体。

 

9. 胶原蛋白酶消化后，向瓶内加入 4 ml KRBH 缓冲液（37°C）。

 

10. 通过搅拌混匀瓶内的细胞，然后用孔径为 250 μm 的尼龙滤网（孔径为 250 μm，放入支持物或漏斗内）将细胞轻轻滤入 50 ml 锥形离心管。

 

11. 通过向离心管内加入 30 ml KRBH 缓冲液（37°C）洗细胞。用台式离心机短时间离心（ 200 g），然后用吸管吸出下清液。注意脂肪细胞浮在水性缓冲液的上面。

 

12. 通过加入 40 ml KRBH 缓冲液洗细胞，离心，除去下清液。重复该步骤 1 次。

 

13. 用 40 ml DMEM-A （DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L（R )-N6-（l-methyl-2-phenylethyl）腺苷（PIA，Sigma）、100 μg/ml 庆大霉素和 25 mmol/L HEPES。按 100 ml 分装，使用前加热至 37°C）（37°C）洗细胞 2 次。

 

14. 用约 40 % cytocrit DMEM-A 混悬漂浮的细胞。

 

二、脂肪细胞的原代培养

 

15. 用 200 μl 大口径吸头将 2 ml 40 % cytocrit DMEM-A 悬液移入 60 mm 培养皿。

 

16. 将培养皿放入湿润的培养箱，在 37°C 和 5 % CO2 的条件下培养 1.5 h 。

 

17. 向培养皿内加入 5 ml DMEM-B（DMEM-A，添加 7% BSA）。

 

此时，应进行葡萄糖摄取实验 [ Quom 1998 ]，检査细胞的活力。