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蛋白质氨基端及羧基端序列分析实验

点击次数：  更新时间：2016/12/9 15:13:17  

 

蛋白质氨基端及羧基端序列分析实验

实验材料: 样品溶液

试剂、试剂盒: 甲醇（HPLC级）、三氟乙酸（TFA）

仪器、耗材: 双向测序柱（Agilent）、氮气供应设备、聚丙烯试管、样品加样器、上样漏斗

实验步骤

 

一、浸润层析柱

 

1.将准备好的两相柱的亲水段（凸向接头）移开，放在一边。

 

2.将柱的疏水段（凹向接头）和上样漏斗装配在一起。

 

3.向下按压上样漏斗并且顺时针旋转，将上样漏斗和柱的疏水段装人样品上样室中。

 

4.将 1ml HPLC 级的甲醇充满上样漏斗。

 

5.旋紧上样器的螺旋盖。

 

6.打开氮气（80psi) 维持足够时间，使上样漏斗变空，但应确保柱床处于浸润状态。

 

7.旋开螺旋盖，重复步骤④~⑥，但要用 1ml 的 2%TFA 水溶液代替甲醇。如果容许填充柱干燥，可重复此步骤。

 

二、准备样品溶液及上样

 

8.用 2%TFA 水溶液稀释样品溶液至 1~5 ml，稀释比至少为 1:1。如果样品溶液在稀释前为 1ml，则要保留上样时的流出液。

 

9.在柱子下面放一个干净的小烧杯或 50 ml 的聚丙烯管，收集过柱的流出液。

 

10.从样品点样器上去掉螺旋盖。

 

11.用样品溶液充满上样漏斗，使 1ml 的样品溶液在 2 min 内过柱。

 

一次能上多于 5 ml 的样品溶液，但需要比较长的上样时间。

 

12.旋紧螺旋盖，调整氮气压力为 80psi。

 

实验提示：保留第11 和12 步的流出液，直至样品已经测序完毕。

 

13.如果上样量较大，可重复步骤⑩??。

 

14.全部上样完成后，以 80psi 氮气干燥柱子 30s。

 

15.去掉螺旋盖，逆时针旋转并松开上样漏斗。

 

16.取出上样漏斗和与其相连的疏水柱，将二者分开。