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聚胺法分离染色质

点击次数：  更新时间：2016/3/14 11:27:19  

实验材料 细胞 
试剂、试剂盒 秋水仙胺 聚胺缓冲液 
实验步骤 有丝分裂中细胞的同步化

1. 37℃，用合适的含有 FCS，抗生素和其他必要成分的培养基培养细胞。

    

2. 收集有丝分裂细胞前 10~16 小时在培养基中以 0.06 μg/ml 的浓度加入秋水仙胺。

收获细胞并在聚胺缓冲液中裂解

 

3. 收获细胞。

对于悬浮培养细胞（500 ml 培养基），室温 1500 g 离心 5 分钟收获细胞。在室温用聚胺缓冲液清洗三次所得到的沉淀，1500 g 离心 5 分钟收集细胞。

 

聚胺缓冲液：

15 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)

0.2 mmol/L 精胺

0.5 mmol/L 精咪

2 mmol/L EDTA

80 mmoI/L KCl

0.1 mmol/L PMSF（临用前从用 100% 乙醇制备的 1 mmol/L 的贮存液中加入）

 

4. 细胞用 20 ml 冰冷的含 0.1％ 毛地黄皂苷的聚胺缓冲液重悬浮。

 

5. 用 Dounce 匀浆器和 B 研棒进行 10 次温和匀浆裂解细胞（过于剧烈的匀浆会导致染色体明显损伤）。另外也可以将悬液温和地吸到一塑料注射器中，然后推动便其通过 25 号针头（应避免溶液起泡沫）。

 

6. 细胞裂解后，取出少量裂解液观察染色质释放情况。在有一滴用来进行 DNA 染色的 2 μg/ml Hoechst 33258 的分离缓冲液溶液的载玻片上，滴一滴裂解悬液。用荧光显微镜观察染色质。

 

7. 用 JS-13 ( Beckman)，HB-4 (Sorvall)，2150 (Herace) 或相似的悬桶式转头在 250 g 离心 1 分钟沉淀裂解液去除碎片。

 

8. 取出含有染色体的上清，3000 g 离心 15 分钟。

 

9. 将含有染色体的沉淀重悬浮于 5~10 ml 的聚胺缓冲液中。制备的染色体可以在 4℃ 保存。保存 2~4 个星期后观察不到形态的变化；但对于特殊目的的研究（例如酶活性，不稳定蛋白），得到的染色体应立即使用。 

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