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荧光PCR法检测RNasin性能效果

点击次数：  更新时间：2016/4/16 9:12:59  

实验目的：对RNasin性能效果进行检测及评估。

 

实验材料及设备

模板RNA：大鼠肌肉组织RNA

引物：Rat β-acting：Forward CCCATCTATGAGGGTTACGC

                     Reverse  TTTAATGTCACGCACGATTTC 

RNase：50mg/ml（simgen）

RNasin：40U/μl

cDNA第一链合成试剂盒（simgen）、2×SYBR Green PCR mix（simgen）

设备：ABI 7000 荧光PCR仪、普通PCR仪、离心机及移液器

其他耗材：0.6ml离心管，八连排管，RNase-free吸头，一次性手套及防护用品和纸巾。

 

实验方法：利用逆转录反应将RNA逆转录成cDNA及SYBR Green荧光PCR方法对RNasin产品的性能效果进行检测评估。

 

实验方案：

编号 RNA量 RNase 量 RNasin量

1 2μg 4ng 0

2 2μg 40ng 80U

3 2μg 4ng 80U

4 2μg 0ng 0

 

 

设计思路：

1. 编号1-4为测试同一批RNasin的性能，1号与3号是测试相同RNA量和RNase量，加不加RNasin对cDNA合成的影响，即RNasin抑制RNase的活性效果。

2. 4号是表示在不添加RNase和RNasin时的空白对照。

3. 2号与3号是测试在相同RNA量和RNasin量的条件下，改变RNase的量，RNasin对不同量的RNase的抑制效果有什么变化。

 

实验步骤：

1.将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、RNasin、RNA(500ng/ul)、RNase、RNA-Free H2O、5×RT Buffer、RT-Enzyme mix、RT-Primer mix 、2×SYBR Green PCR Mix、引物、在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。

注：RNase稀释需在抽风口或远离PCR操作室的实验室。

 

2. 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育30min，以保证RNase有充分时间去降解RNA。然后置于冰上放置。

表1  gDNA去除反应体系

试剂

编号 1 2 3 4

5×gDNA Buffer（μl） 2 2 2 2

RNA（μl）*1 4 4 4 4

RNase（ng）*2 2 20 2 —

RNasin（μl）*3 — 2 2 —

RNA-Free H2O（μl） 补足到10μl 

 

 

 

 

 

 

 

 

注：1.  RNA的浓度是500ng/μl,RNA的浓度不能太低，且RNA需在RNase之前添加，否则可能被RNase降解完从而在荧光PCR上反映不出差异。

2.  RNase的浓度分别为1ng/μl和10ng/μl，故在加入RNase时均加入2μl，保证不同的量相同体积，以减少误差，在加RNase的时候应尽量在无RNase的环境中添加，以免环境中RNase过多而导致RNA降解严重从而在荧光PCR上反映不出差异。

3.  RNasin的浓度为40U/μl，添加RNasin应在加RNA之前添加。

 

    后续cDNA合成步骤参考cDNA第一链合成试剂盒（simgen）说明书操作。所得cDNA稀释5倍，置于冰上备用。

 

    荧光PCR步骤参考2×SYBR Green PCR Mix（simgen）说明书操作。

    将稀释好的cDNA模板按照5μl/管加入到荧光PCR反应体系混合液中，进行荧光PCR扩增，观察实验结果。

 

实验结果：

从上图看，在加2ng RNase时，加不加RNasin对cDNA的合成是有明显影响的，即3号比1号的CT值要小6个CT，表示它们的起始cDNA浓度相差大概26倍,说明RNasin对RNase的影响是非常大的。

从2号与3号对比，说明在相同量的RNasin下，当RNase的量增加到20ng时，80U RNasin的效果还不足将RNase完全抑制，说明一定量的RNasin只能对一定量的RNase有足够的抑制作用。