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凝胶迁移实验（EMSA）

点击次数：  更新时间：2016/5/20 10:54:58  

实验方法原理

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

 

 

 
实验材料 DNA样品 

试剂、试剂盒 [γ-32P]ATP T4多聚核苷酸激酶 Nuclease-Free Water T4多聚核苷酸激酶缓冲液 醋酸铵 TE

无水乙醇 TBE buffer 重蒸水 甲叉双丙烯酰胺 丙烯酰胺 甘油 过硫酸铵 TEMED（四甲基乙二胺）

EMSA Gel-Shift结合缓冲液 溴酚蓝 

仪器、耗材 水浴锅 PCR仪 离心机 电泳仪 电泳槽 

实验步骤 一、探针的标记
 
1.   如下设置探针标记的反应体系：
 
（1）待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。
 
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。
 
（3）Nuclease-Free Water ：5微升。
 
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。
 
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。
 
（6）总体积 10微升
 
（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
 
2.   使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
 
3.   加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
 
4.   再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
 
5.  标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
 
二、 探针的纯化
 
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：
 
1.  对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。
 
2.   在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
 
3.  在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。
 
4.   在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
 
5.   加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。
 
三、EMSA 胶的配制
 
1.   准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
 
2.   按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
 
（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。
 
重蒸水 16.2毫升。
 
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。
 
（3）80% 甘油： 625微升。
 
（4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升。
 
（5）TEMED ：10微升
 
3.  按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
 
四、EMSA结合反应
 
1.   如下设置EMSA结合反应
 
阴性对照反应：
 
(1）Nuclease-Free Water ：7微升。
 
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
 
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。
 
（4）标记好的探针 ：1微升。
 
（5）总体积 ：10微升。
 
样品反应：
 
（1）Nuclease-Free Water ：5微升。
 
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
 
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。
 
（4）标记好的探针： 1微升。
 
（5）总体积： 10微升。
 
探针冷竞争反应：
 
（1）Nuclease-Free Water ：4微升。
 
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
 
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。
 
（4）未标记的探针： 1微升。
 
（5）标记好的探针： 1微升。
 
（6）总体积 ：10微升。
 
突变探针的冷竞争反应：
 
（1）Nuclease-Free Water ：4微升。
 
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
 
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。
 
（4）未标记的突变探针： 1微升。
 
（5）标记好的探针： 1微升。
 
（6）体积 ：10微升
 
Super-shift反应：
 
（1）Nuclease-Free Water：4微升。
 
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
 
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。
 
（4）目的蛋白特异抗体 ：1微升。
 
（5）标记好的探针：1微升。
 
（6）总体积 ：10微升。
 
2.   按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
 
3.   加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
 
五、 电泳分析
 
1.  用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
 
2.   把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
 
3.   按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
 
4.   剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边 缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
 
5.  干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检。

 

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