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RNA干扰

点击次数：  更新时间：2016/9/30 14:42:57  

RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性，所以是基因功能研究的重要工具。

siRNA是一类长约21～25 个核苷酸的双链小RNA分子，可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可进入上述循环。新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象.

RNA干扰实验

将制备好的siRNA和其表达载体转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、 DEAE- 葡聚糖和 polybrene 、机械法（显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。

脂质体型转染

一、注意事项

1. 转染试剂的用量

2. siRNA（小干扰RNA）的用量

3. 转染时的细胞密度

4. 转染时的操作顺序

5. 细胞与转染试剂 /siRNA（小干扰RNA）复合物的温浴的时间

二、转染步骤

选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要. siRNA和脂质体的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。

1. 转染前一天， 将细胞接种在 6孔板上，24小时贴壁后细胞密度达到70%-90%；

2. 转染前，用基础培养基opti-MEM漂洗细胞2次，加入无血清基础培养基opti-MEM 1.5mL；

3. 将溶解后的siRNA稀释于250?l无血清的基础培养基opti-MEM中；取5-10ul脂质体混匀于250?l无血清的基础培养基opti-MEM中。静置5min；

4. 将脂质体稀释液及siRAN稀释液混合，轻轻混匀，室温放置20分钟；

5. 将脂质体-siRNA混合液加入细胞培养孔中；

6. 6小时后吸弃转染复合物，换入含10%胎牛血清的新鲜培养基；

7. 细胞在 CO2 培养箱中 37 ℃温育 24h-48h 后，进行转染后的其它检测步骤.