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常见细胞转染方式

点击次数：  更新时间：2017/10/17 10:29:17  

常见细胞转染方式

磷酸钙共沉淀

原理：该法可用于瞬时或稳定转染。然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感，所得结果容易出现差异，且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性，转染效率较差。

  

实验步骤：将核酸与氯化钙在磷酸盐缓冲液中混合，同时控制好pH、温度等条件 → 室温孵育，生成浓缩DNA的极小不溶性颗粒沉淀 → 将颗粒型沉淀分散到细胞中，促进DNA粘附在细胞表面 → 共沉淀通过内吞作用进入胞浆 → 分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性传染。

人工脂质体法

原理：带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。这种方法几乎适用于所有细胞，转染效率高、重复型好，但转染时需要去除血清，转染效果随细胞类型变化大。

 

实验步骤：在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂 → 脂质体与核酸的磷酸骨架结合，形成复合物 → 脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合 → 复合物通过内吞作用进入胞浆 → 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。

病毒转染

原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。可用于蛋白质过表达或抑制，是临床研究中最常用的方法。它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中，可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。

 

实验步骤：通过基因克隆生成重组病毒 → 采用非病毒法转染包装细胞系，扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞（含有病毒特异性的受体）→去除培养物中的病毒，并加入新鲜培养基→分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。

电穿孔法

原理：利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔使核酸物质能穿过孔进入细胞。

实验步骤：将细胞悬浮于点穿孔缓冲液中，制备细胞 → 在特定缓冲液存在的条件下吗，对细胞施加合适的电脉冲 → 电脉冲在细胞膜上形成电势差，形成临时孔，使核酸进入细胞 → 使细胞恢复生长状态，复苏 → 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。