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我的成功经验，如何做多克隆抗体的制备？

点击次数：  更新时间：2017/10/18 9:58:50  

多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。本章跟随中洪君，先来学习下单克隆抗体的制备！

单克隆抗体及多克隆抗体的优劣对比

实验材料需要哪些？

⒈ 实验动物：成年兔。

⒉ 实验器材：特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

⒊ 实验试剂

⑴ 抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

⑵ 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分。

下面开始实验方法教程

⒈ 抗原的制备

抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。

⒉ 预放血

①将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易，按压兔子耳根部直至血管突出；

②将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml；

③结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，用乙醇消毒。

④取收集的血液在37°C恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。

⑤用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。

⒊ 注射抗原 

⑴ 准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。

从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。

捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。

注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。

⑵ 每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。

⒋ 收集血液

⑴ 将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。

⑵ 将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。

5、免疫血清的鉴定

效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。

特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法

纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。

 

IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。

亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、ELISA或RIA竞争结合试验等。

6、免疫血清的保存

注意点：保存前需经除菌、保存液含防腐剂、避免反复冻融（分装）。