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测定RNA浓度和纯度，这些要点要知道

点击次数：  更新时间：2017/10/19 10:01:51  

实验原理

一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度。OD230代表其他杂质（多糖等）的吸光度。一般认为，OD260/OD280的比值在1.8至2.0之间认为RNA居多且较纯。当比值低于1.8时，考虑有蛋白质或酚污染；当比值高于2.0时，表明可能有异硫氰酸残存。 

（实拍图）

具体操作

1、UV-1600PC紫外分光光度计开机预热20min；

2.设定紫外波长 260nm，用ddH2O洗涤比色皿，向比色皿中加入 50ul ddH2O，放入样品室的S池架上，校零；

3.将待测样品稀释（RNA 5ul用ddH2O稀释至50μl）混匀后，记录编号和稀释倍数；

4.把混匀的待测样品移入干净的比色皿中，放进样品室的S架上，记录稳定的OD260(A260)的值；

5.以同样的方式测待测样品在280nm下的OD值；

6.计算待测样品的浓度与纯度:

RNA样品的浓度（ng/μl）=OD260×稀释倍数×40;

纯度=OD260/OD280

举例说明

某客户某一组样品RNA测得OD260=1.016Abs，OD280=0.533Abs

根据计算公式可得：

      

RNA浓度  1.016×40×10=406.4 ng/ul

       

RNA纯度  1.016/0.533=1.906

  

此浓度和纯度均适合做PCR。

问题分析

 

(1)蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

(2)苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

(3)多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

(4)设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间，此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10 mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。