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稳定表达细胞系的构建，你需要知道这些

点击次数：  更新时间：2017/10/26 9:57:29  

那是一个阳光明媚的上午，正要去参加，突然接到导师的电话说是试剂到了，可以开始构建稳定细胞系了····

两种构建稳定细胞系的方法，分别为使用转座子和慢病毒载体构建，产生非靶向外源基因整合，另一种方法是使用位点特异性重组酶，使外源基因靶向整合。传统构建细胞系的方法是通过非同源DNA末端连接的方法构建质粒后转染细胞。

稳定细胞系构建原理

真核蛋白表达稳定细胞系建立的原理是，将我们所要的目的基因真核到宿主细胞上，随着细胞的生长繁殖，目的基因可以稳定的表达，在通过抗生素的不断加压筛选，最终得到构建稳定细胞系的过程。相对于瞬时转染，稳定转染技术持续周期长，细胞整合稳定，能够满足后期对蛋白的大量需求。

稳定细胞系构建之实验流程

1.细胞培养

细胞培养是真核蛋白蛋白实验中的第一步，原核利用大肠杆菌，真核蛋白表达是培养哺乳动物细胞，常用的真核蛋白表达细胞有CHO,HEK293细胞，稳定细胞系建立选择CHO细胞。

冻存管

2、细胞复苏

1）预先加热水浴锅，温度至37-40℃，并在离心管中准备好10ml培养基；

2）从液氮罐或冰箱中取出细胞，迅速放进预热的水浴锅中，镊子夹住冻存管晃动，使其受热均匀；

3）当冻存管内完全融化时，注意用酒精擦拭冻存管消毒，将液体倒入含有10ml培养基的离心管中；

4）离心5min，去除上清，得到沉淀；

5）用培养基悬浮沉淀，并接种到培养瓶常规培养；

细胞复苏后，生长一段时间，95%的细胞贴壁生长，细胞状态良好，说明细胞复苏成功。

稳定表达细胞系构建

嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）

1. 在24 孔板内接种细胞，约3x104/孔，共11孔，培养过夜。

2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%。稀释嘌呤霉素 (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μg/ml)至培养基, 每孔加入0.75ml培养基。

3. 每隔2天观察细胞的存活情况（贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准），每隔2天更换0.75ml含相应浓度嘌呤霉素的培养基。

4. 筛选4-7天内使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为杀伤浓度（筛选浓度）；

嘌呤霉素筛选稳定转染细胞

1. 转染（24孔板进行）或电转后培养24小时，按10%密度传代（传至35mm平皿），继续培养24小时，待细胞密度增至20％～25％汇合时；

2. 去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度（杀伤曲线实验确定）配制好的嘌呤霉素筛选培养基2-3ml。

3. 根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔2天更换一次筛选培养基 (培养基用量为2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在3-4天内出现细胞大量或少量死亡情况（如果转染效率或电转效率高，则死亡少；如果转染效率或电转效率低，则死亡多；如果筛选浓度偏低，筛选培养基用量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆）。如果筛选第一周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周；如果筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按10%密度传代（传至35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃），利用筛选培养基进行筛选一周；

4. 筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释（10ul培养基中含1个细胞，用筛选培养基），把上述10ul细胞悬液加入96孔板中（提前加入40ul筛选培养基），一共加24孔，4小时后观察每个孔的情况，记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃；

5. 根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为80%时，将其传代至24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至6孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至T25瓶（一传3）中增殖, 每隔3天换液。

6. 细胞大量扩增后，一瓶用于提取总RNA进行QPCR检测，一瓶用于总蛋白进行WB检测，另一瓶用于保种，根据QPCR和WB结果取舍阳性克隆。