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质粒的制备技术，你知多少？

点击次数：  更新时间：2017/10/8 15:06:42  

Hello，又到了技能up up up单元在我们的细胞实验中经常会用到质粒DNA，那么具体是怎么来的呢？今天先来讲是质粒的制备步骤，各位接好了哟~~

一、质粒的制备原理

质粒是一种双链共价闭合的环状DNA，是染色体以外的稳定遗传因子。已经在细菌、真菌以及部分动植物细胞中发现质粒，以细菌中存在质粒最为普遍。质粒的制备与提取是分子克隆的基本技术，主要依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将两者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、质粒的制备操作前准备

仪器设备：PCR仪、37℃恒温培养箱、37℃恒温摇床、水浴锅、超净工作台、高速离心机等等。

试剂：过表达载体质粒（pGL3-Basic等）、限制性内切酶、胶回收试剂盒、感受态大肠杆埃希菌DH5ɑ、质粒提取试剂盒等等。

三、菌落制备主要环节

（一）扩增Lin28A启动子

1. 以HepG2基因组DNA为模板，扩增Lin28A启动子，长度1480bp。

引物：

上游引物：5′-CCGCTCGAGGGTGGTTACTCTCAAACAAGG-3′

下游引物：5′-CCCAAGCTTCAGAGACTCACGGCGGGACAAG-3′

分别在上下游引物上引入XhoI/Hind Ⅲ内切酶位点。

2. PCR产物回收：依照琼脂糖凝胶回收试剂盒操作进行。

（二）双酶切

将PCR回收产物和pGL3-Basic空载体同时进行双酶切。

1.双酶切体系

（1）DNA回收片段酶切的试剂和剂量如下：

     

Xho Ⅰ                          1ul

     

Hind Ⅲ                         1uL

     

DNA片段（300ng）               _uL

     

DDW                            20uL

（2）pGL3-Basic空载体酶切的试剂和剂量如下：

     

Xho Ⅰ                          1ul

     

Hind Ⅲ                         1uL

     

质粒（500ng）                   _uL

     

DDW                            20uL

2.双酶切产物回收

    

依据琼脂糖凝胶回收试剂盒操作进行。

 

（三）连接

将回收的PCR产物连接入pGL3-Basic载体中，反应体系如下：

T4 连接酶                      1uL

5×buffer                       1uL

酶切质粒（50ng）              _ul

酶切DNA片段（100ng）        _uL

DDW                         20uL

* 16℃连接8-10h，或者室温连接10min。

（四）转化

1、将感受态细胞DH5ɑ从-80℃冰箱中取出，立即置于冰中，使其在冰中融化。

2、连接产物加入DH5ɑ感受态细胞溶液中，轻轻吹打使连接产物分布均匀。

3、冰浴30min。

4、42℃水热击90s，此时切勿振荡

5、立即冰浴2min。

6、加入800ul 37℃预热的LB培养基转化的菌液中。

7、37℃，110rpm,振荡培养60min。

8、制备加抗生素的LB琼脂平板：取出50℃预热的灭菌LB琼脂培养基，按照终浓度100 ug/ml加入抗生素，摇匀，将LB培养基倒入灭菌的培养皿中，15-20ml/平皿。待培养基凝固后，做好标记备用。

9、在超净工作台中将37℃培养的转化菌液，按照每平皿100ul 菌液的量轻轻加到已经凝固的LB琼脂培养基表面，用无菌涂布棒按照“Z”字形涂均匀。

菌落PCR初步鉴定，阳性克隆后进行基因测序。