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苏木精-伊红染色

点击次数：  更新时间：2017/10/8 17:13:19  

苏木精-伊红染色

背景一：

组织易被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性和嗜酸性。构成组织蛋白质的氨基酸种类很多，具有不同的等电点，普通染色中染色液的酸碱度为6.0左右时，细胞内酸性物质（如细胞核染色质、腺细胞、和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等）被碱性染料染色，称为嗜碱性，而细胞中的其他蛋白质（如红细胞的血红蛋白、嗜酸性细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等）被酸性染料染色，称为嗜酸性。染色液的PH可直接影响染色反应，当染色液的PH升高时，原来的嗜酸性物质可被碱性染色液着色变为嗜碱性，当染色液的PH降低时，原来的嗜碱性物质可被酸性染色液着色变为嗜酸性。

背景二：

苏木素-伊红染色法是石蜡切片的常规染色方法，能够较好地显示组织结构和细胞形态，用于观察、描述正常和病变组织的形态学，并可保存较长时间。碱性苏木素染料容易与带负电荷/呈酸性的脱氧核糖核酸（DNA）磷酸基以离子键方式结合，故细胞核内的染色质与胞质内的核糖体呈紫蓝色。化学合成的酸性伊红染料在水中解离成带负电荷的阴离子，并与蛋白质氨基带正电荷的阳离子结合，将细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等染成不同程度的红色或粉红色。

二．染色流程

常规脱蜡

1.苏木素染色2-10min

2.水洗

3.盐酸乙醇溶液分化30s-1min

4.水洗

5.反蓝液反蓝30s-1min

6.伊红染色液染色1-3min

7.梯度酒精快速脱水

8.二甲苯透明3次，5min/每次

9.封片

三．染色结果

1、细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色；

2、软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色；

3、粘液呈灰蓝色；

4、细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色；

5、胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色；

6、胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色；

7、红血球呈橘红色，蛋白质类液体呈粉红色。

注：细胞或组织的着色情况与其种类有关，同时也随其生活周期及病理变化而发生改变。（例如：很多   细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。 胶原   纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。）

四.HE染色技术几种常见的染色问题

1.脱蜡方面：

切片中白色的区域脱蜡不彻底，染色液由于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。

 

原因：①烤( 烘) 片温度太低，脱蜡前没有充分烤( 烘) 干。 ②二甲苯脱蜡时间不足， 或二甲苯使用过久，造成脱蜡不尽。

 

对策：①用无水乙醇去掉玻璃片上的水分，重新二甲苯脱去石蜡。 ②切片需退回到脱蜡步骤，延长脱蜡时间，或更换二甲苯，脱色、漂白、重新染色。

2.染色：

 

（1）苏木素染色方面

 

A.苏木素染色太浅，细胞核与细胞质颜色对比度差。

 

原因：染色时间短；苏木素过度氧化，失去染色能力；分化时间过长。

 

对策：切片重新染色。

 

B.细胞核过染， 核膜、核仁等不清晰， 细胞质( 尤其是皮肤上皮细胞) 含有大量的细胞核染色液苏木精， 导致细胞核与细胞质比例失调。

 

原因：染色液时间过长、切片太厚、分化步骤时间太短。

 

对策：如果切片不是因为太厚，那么就因该脱色、重新染色， 对于染色和分化时间做些适当的调整。若太厚则需要重新切片。

C.切片细胞核染后呈棕色，这表明苏木精没有充分蓝化， 或苏木精过度氧化失去染色能力

 

原因：苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。

对策：染色前检查苏木精染色液的染色能力，过渡氧化，应及时更换。其次，在苏木精染色后， 给切片以足够的蓝化时间。

  

D.染色后有杂质

 

原因：苏木精染色液中的金属膜黏附在玻片上。

对策：每天染色前仔细过滤苏木精染色液，或建议使用半氧化苏木精染色液。

伊红着色方面：

 

A.切片中央区域伊红染色不均匀， 可能为弱碱性溶液残留导致伊红拒染所致。

 

原因：伊红染液的pH 值可能大于5 ；也可能是蓝化液残留过多；切片太薄；或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。

 

对策：检查伊红染液的pH值，用乙酸将其调节在4.6-5.0 之间，使伊红染色色彩艳丽；

确保每次蓝化后，用自来水冲洗干净；

检查切片的厚度；

脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长， 因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。

B.伊红深染导致细胞核与细胞质没有层次，缺乏对比度。

  

原因：伊红染色液浓度太高；

切片在伊红染色时间过长；

切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过快，而使乙醇分化伊红的作用不能产生。

 

对策：适当稀释伊红染色液，减少伊红染色时间；

或者使切片在乙醇脱水等步骤时，停留时间相对均匀；

检查切片的厚度是否合适。

封片

 

A.在显微镜下呈现大量水珠或云雾状改变

 

原因：切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水， 导致二甲苯透明，中性树胶封固后残留大量水分。

也可能是封片的时候出现的气泡。

 

对策：移去盖玻片， 用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇换几道。待切片重新脱水完全后，用新二甲苯透明， 中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间以后，应即时更换。将切片浸如二甲苯中，重新封片。

B.盖玻片上有封固剂所致切片组织模糊不清

 

原因：盖玻片上可能有封固切片的封固剂。

对策：移去盖玻片， 重新用干净的盖玻片封片。

 

C.封片后镜下则会出现类似色素的点状结晶或类似“裸核”样的改变

 

原因：切片封片前放置在空气中时间太长， 以至于二甲苯挥发后，切片过于干燥所致。

对策：移去组织切片上的盖玻片和封固剂， 重新处理。

将切片水洗数分钟，然后重新脱水、透明、封固。

封片过程中要保持组织切片的轻度湿润，尽量不要让其干燥。