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菌落PCR

点击次数：  更新时间：2017/11/21 11:58:42  

实验方法原理

直接挑取菌落进行PCR，PCR的95℃加热可以破胞，释放基因组DNA或质粒，成为PCR体系的模板，然后进行链式扩增。

实验材料 基因样品

试剂、试剂盒  dNTPPCR混合液

仪器、耗材  PCR仪

实验步骤

 

1.  PCR混合液的制备

（1）Taq buffer（10×） 180 ul

（2）dNTP（2.5 mM） 20~25 ul

（3）Primer Forward（引物浓度在10 Pmol） 5 ul

（4）Primer Reverse（引物浓度在10 Pmol） 5 ul

（5）ddH2O 147 ul

（6）Taq（2 U/ul） 12~15 ul

2.  常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落（强调单个，不能是双克隆），在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝。

3.  然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR管中或者96空pcr反应板（管子做好记号，如平板上点的是1#，则管子上也标1#，以便筛选到克隆后的扩到培养）。

4.  挑好单克隆菌落后将之前配制好的PCR混合液加入体系是30 ul。

5.  将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。

6.  将扩增出来的反应液中加入溴酚蓝或是其他染料，电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

7.  将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜，使菌落扩增。

8.  次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。

注意事项

1.  设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

2.  使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。（转帖）