肿瘤细胞免疫治疗在肿瘤患者术后复发预防和全身多处微转移灶清除中发挥重要作用。PET显像作为一种核素标记示踪的分子影像技术，能够对体内的过继免疫细胞进行迁移定位、肿瘤靶向、数量扩增、细胞活化及免疫功能发挥等多方位的动态连续监测，从而对肿瘤细胞免疫治疗进行临床指导和疗效评估。肿瘤细胞免疫治疗的PET显像研究经历了免疫细胞体外直接放射性核素标记、免疫细胞体内报告基因间接放射性核素标记和免疫细胞体内内源性分子直接放射性核素标记3个阶段。本文着重阐述PET报告基因显像这一阶段，探讨相关研究进展及面临的问题和挑战，从而为日后肿瘤细胞免疫治疗PET报告基因显像的基础研究和临床研究提供新方向和新思路。
1.肿瘤细胞免疫治疗的PET报告基因显像
对于肿瘤细胞免疫治疗的在体可视化核素显像监测，最早采用的方法是将免疫细胞预先进行体外放射性核素直接标记，然后将标记后的细胞回输到体内，最后进行核素显像。但是核素的自我衰变、标记核素的在体代谢清除以及标记免疫细胞的在体扩增，均可导致核素探针在体剂量的极速衰减，从而无法实现肿瘤细胞免疫治疗的长期动态可视化监测。此外，体外标记过程中所使用的大剂量放射性核素也会对免疫细胞的状态和功能造成一定的影响，并最终影响其在体内的抗肿瘤免疫活性。这在很大程度上影响和限制了免疫细胞的体外直接标记PET显像技术的进一步发展和应用。
免疫细胞的PET报告基因显像，能够克服直接标记技术的众多不足，从而实现肿瘤细胞免疫治疗的全身、无创、长期、连续动态监测。首先，在体外通过基因工程学技术，使治疗用免疫细胞及其子代细胞稳定表达PET报告基因相关蛋白，然后将这些基因修饰后的免疫细胞回输到肿瘤患者体内，选择合适的时间点，向机体内输注核素标记的PET报告基因探针，通过与报告基因相关蛋白特异性结合，实现核素标记探针在免疫细胞表面或胞内的特异性富集，最终通过PET显像实现免疫细胞的在体可视化成像。
根据报告基因相关蛋白与报告基因探针之间相互作用方式的不同，可将报告基因分为酶类、受体类、转运体类3种不同类别。
（1）酶类报告基因。HSV1-tk报告基因是目前研究较为深入、应用较为广泛的一种酶类PET报告基因。其没有严格的底物特异性，可以与核素标记的核苷类似物（底物探针）相结合并催化其磷酸化，从而将其捕获至细胞内，通过PET显像实现免疫细胞的在体可视化报告基因成像。为了进一步提高HSV1-tk报告基因显像的灵敏度和特异性，Likar等构建了HSV1-tk报告基因的突变衍生物HSV-sr39tk（39位丝氨酸突变为精氨酸）。与此同时，与野生型和突变型HSV1-tk特异性结合的报告基因探针也得到了充分研究和发展，如4-[18F]氟-3-[羟甲基]丁基鸟嘌呤{4-18F-fluoro-3-[hydroxymethyl]butyl guanine，18F-FHBG}、2′-脱氧-2′ - [18F]氟-5-乙基-1-beta-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶{2′-deoxy-2′-[18F]fluoro-5-ethyl-1-beta-D-arabinofuranosyluracil，18F-FEAU}和2′-氟-2′-脱氧-5′-[124I]碘1-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶{2′-fluoro-2′-deoxy-5′-[124I]iodo-1-D-arabinofuranosyluracil，124I-FIAU}等。通过体内和体外实验，Miyagawa等对多种HSV1-tk报告基因探针的PET显像有效性进行了比较。
总体而言，124I-FIAU和18F-FEAU探针在PET显像的灵敏度和信噪比方面优于18F-FHBG，但是在探针合成方面，18F比124I更易获得。Dotti等在2只灵长类动物体内进行的显像研究显示，18F-FEAU PET/CT能够在多个淋巴器官及感染部位观察并监测到过继回输于机体内的、表达HSV-sr39tk报告基因的猕猴自身多克隆T淋巴细胞。18F-FHBG及其PET显像已经FDA批准可以用于临床。在1篇脑胶质瘤患者的个案报道中，同时表达HSV1-tk报告基因以及肿瘤靶向受体治疗基因的CD8＋细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）在静脉回输于患者体内后，不但能特异性靶向肿瘤组织局部，还可通过PET显像实现细胞在肿瘤组织局部的可视化监测。过继回输免疫细胞的活化状态及功能的发挥对于肿瘤细胞免疫治疗的成功与否至关重要，而HSV1-tk报告基因及124I-FIAU报告探针系统能够有效监测T细胞活化状态。除了作为报告基因用于报告基因分子显像外，HSV1-tk还是一种很重要的自杀基因，在肿瘤基因治疗中发挥重要作用。表达HSV1-tk的肿瘤细胞，能够将无毒性的药物前体（如阿昔洛韦、更昔洛韦等）进行磷酸化，使其成为有毒性的三磷酸核苷类似物，该类似物可以取代正常DNA合成过程中的三磷酸核苷酸，抑制细胞DNA聚合酶，使DNA链的延长终止，从而抑制蛋白质的合成，导致肿瘤细胞死亡。
非人源化的酶类报告基因中，除了HSV1-tk外，还有水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（varicella-zoster virus thymidine kinase，VZV-tk）和β-半乳糖苷酶（LacZ）。与报告基因VZV-tk相对应的报告探针——双环核苷类似物（bicyclic nucleoside analogues，BCNA）能通过血-脑屏障，有可能应用于中枢神经系统肿瘤的PET报告基因显像，从而在一定程度上解决了HSV1-tk报告基因及相应探针系统不能突破血-脑屏障方面的问题；而报告基因LacZ及其探针系统多应用于MRI。
（2）受体类报告基因。SSTR属于7次跨膜G蛋白偶联受体家族，共有5种受体亚型，在小鼠和人类中，该受体高度保守，并且在绝大多数组织器官中表达量均较低。但是，由于在多个人类肿瘤类型中均检测到人源SSTR2（human SSTR2, hSSTR2）的高水平表达，以hSSTR2为靶点的肿瘤治疗和PET报告基因显像监测得以迅速发展。在以多种核素标记的生长激素抑制素衍生物作为报告探针的hSSTR2 PET报告基因显像研究中，因能在hSSTR2表达阳性的细胞中迅速内化富集，而且脱靶探针能够迅速通过泌尿系统代谢清除，68Ga-DOTA-TOC在众多的hSSTR2特异性报告探针中尤其受人关注。小动物68Ga-DOTA-TOC PET显像研究结果表明，药物注射后2 h，就能在稳定表达hSSTR2报告基因蛋白的肿瘤部位检测到68Ga-DOTA-TOC的特异性浓聚，其摄取值是肌肉的500倍，是普通荷瘤部位的64倍。68Ga-DOTA-TOC的hSSTR2 PET报告基因显像有望成为肿瘤基因治疗和细胞治疗过程中重要的在体无创分子影像监测手段。
相对于酶类报告基因而言，受体类报告基因目前在肿瘤细胞免疫治疗PET报告基因显像研究中的应用较少。但是，因hSSTR2等受体类报告基因蛋白多属于人源蛋白，可以避免在人体研究应用过程中的免疫原性问题，因而其发展前景较为乐观。除hSSTR2外，多巴胺2型受体（dopamine 2 receptor, D2R）及其突变体（D2R80A）作为报告基因相关蛋白用于分子影像研究也较为多见，包括PET报告基因显像及MRI报告基因显像。
（3）转运体类报告基因。人源NIS（human NIS, hNIS）是一种人体固有的跨膜糖蛋白，可作为一种报告基因相关蛋白用于过继免疫细胞的在体PET动态监测。巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞，在慢性炎性病变、恶性肿瘤等的发生发展过程中发挥着重要作用，实现巨噬细胞的在体无创动态可视化监测，对于疾病的诊断、治疗和预后判断意义重大。Seo等的研究显示，稳定表达hNIS蛋白的巨噬细胞株（RAW264.7/hNIS）与未经改造的巨噬细胞系（RAW264.7）相比，其在细胞增殖能力、细胞因子分泌活性和吞噬活性等方面，并没有发生显著改变，但其体外125I摄取值却升高了约65倍；进一步的小动物PET显像结果表明，皮下注射了RAW264.7/hNIS细胞的炎性病变模型裸鼠，其炎性病变局部的124I摄取值是注射RAW264.7细胞的炎性病变模型裸鼠的2.12倍，说明hNIS报告基因PET显像能够有效监测巨噬细胞迁移至炎性病变局部这一动态过程。树突状细胞（dendritic cell, DC）是机体功能最强的专职抗原提呈细胞，在机体免疫反应、肿瘤疫苗治疗和肿瘤细胞免疫治疗中均发挥重要作用，所以实现DC的在体动态监测能够有效指导肿瘤的免疫治疗。Lee等的研究显示，在C57BL/6小鼠的左右足跖处分别注射原始的DC和稳定表达hNIS的DC，注射1 d后的124I小动物PET/CT显像结果表明，后者引流淋巴结区域的124I摄取量显著高于前者，且这种显著摄取可以持续增高并维持到注射第4天。由此可见，将hNIS作为PET显像报告基因，能够有效监测DC的在体迁移情况，有助于优化基于DC的肿瘤细胞免疫治疗策略。
人源的去甲肾上腺素转运体（human norepinephrine transporter, hNET）也是一种细胞跨膜蛋白，也可作为一种报告基因相关蛋白用于PET显像。与hNET相对应的报告探针，如123I-MIBG或124I-MIBG已广泛应用于临床。但是其显像时间点在注射后24 h，如果能够合成适合18F标记的MIBG类似物[如间位氟代苄胍（meta-fluorobenzylguanidine, MFBG）和对位氟代苄胍（para-fluorobenzylguanidine, PFBG）]，基于hNET报告基因显像时间点将能够提前至注射后8 h内。研究表明，通过构建稳定表达hNET蛋白的大鼠胶质瘤C6细胞株（C6/hNET）和荷C6/hNET小鼠模型，18F-MFBG探针能够于药物注射后1～4 h对小鼠异体移植瘤进行PET显像；此外，18F-MFBG还具有标记合成条件温和、机体清除快、非靶组织摄取少等优点，是一种优越的hNET特异的PET报告基因探针。
2.人源化的PET报告基因研究
限制肿瘤细胞免疫治疗的PET报告基因显像研究发展的一个重要因素就是外源性报告基因相关蛋白的免疫原性问题。细菌或病毒来源的报告基因相关蛋白作为一种外源蛋白，会引发免疫活性个体的抗报告基因相关蛋白的免疫反应。在HIV感染的患者体内，的确也检测到了针对报告基因蛋白相关胸苷激酶（thymidine kinase, TK）的HIV特异性CTL细胞的免疫排斥反应，而人源化的报告基因蛋白能够有效解决这一问题。利用人源性的线粒体2型TK蛋白（human mitochondrial thymidine kinase 2, hmTK2）作为报告基因相关蛋白标记免疫细胞，通过以124I-FIAU和18F-FEAU作为报告探针的PET显像，可以实现免疫细胞在体的长期动态可视化监测。尽管hmTK2在哺乳动物细胞的线粒体中广泛表达，但其并不能有效接触到作为其底物的尿嘧啶核苷类似物报告探针。通过构建hmTK2的截短体，让其在细胞胞质中表达，便能有效识别尿嘧啶核苷类似物报告探针，从而实现PET报告基因显像。在1项多种人源PET报告基因的对比研究中，研究者通过构建hNET、hNIS、HSV1-tk、人源脱氧胞苷双突变体（human deoxycytidine kinase double mutant, hdCKDM）等报告基因相关蛋白稳定表达的T细胞，并将其分别注入小鼠皮下，再通过在体T细胞的报告基因PET显像，探讨并研究不同人源报告基因类型对T细胞在体PET显像的灵敏度，结果表明，相比于18F-FEAU/hdCKDM、124I/hNIS和18F-FEAU/HSV1-tk系统，18F-MFBG/hNET PET系统的灵敏度最高，在体T细胞监测量可低至3.5×104 ～4.0×104级别。
人源化报告基因的PET显像目前是一个研究热点，但其中仍存在2个潜在问题：（1）当人源化报告基因在机体某些组织细胞中有内源性表达时，如何实现过继免疫细胞特异性的PET报告基因显像；（2）免疫细胞中该人源化报告基因相关蛋白是否会发挥类似于内源性蛋白的功能，从而影响免疫细胞自身的功能。这些都有待在日后人源化报告基因研究过程中逐步加以解决。
3.肿瘤细胞免疫治疗的报告基因多模态显像
任何一种报告基因和分子影像手段都存在一定的局限性。对于受体或转运体类报告基因而言，因涉及到蛋白折叠、胞内运输和在细胞膜表面的整合定位等多个步骤，可能会对报告基因PET显像产生影响；而对于酶类报告基因而言，虽然存在酶类催化反应的放大效应，但是报告探针需要穿透细胞膜进入细胞内，在被酶类报告基因相关蛋白催化后，才能得以显像，这在一定程度上也会影响到报告基因显像的效能。基于多种报告基因类型和多种分子影像手段的多模态显像也因此成为目前报告基因分子显像领域的另一研究热点。表达光学报告基因相关蛋白（如GFP和荧光素酶等）和PET报告基因相关蛋白（HSV1-tk）融合蛋白的造血干/祖细胞和间充质干细胞，再次回输到机体内后，可通过光学和PET显像对其进行在体的长期动态监测。Mayer-Kuckuk等将表达了HSV1-tk、GFP和萤火虫荧光素酶等多种报告基因融合蛋白的骨髓细胞注入小鼠体内，通过PET和光学显像，观察并长期动态监测了移植骨髓细胞在体的生物学分布及数量和功能变化。与此同时，PET/MR和光学PET（opti-PET）等分子影像设备的研发和应用也正在日益兴起。
综上，PET报告基因显像作为一种先进的在体无创分子影像手段，在肿瘤细胞免疫治疗的临床研究中应用越来越广泛，能够实现对免疫细胞在体运输、生物学分布、存活扩增、活化状态和免疫功能发挥等的长时间连续动态监测。HSV1-tk及其突变衍生物是目前研究较为深入、应用也较为广泛的一种酶类报告基因相关蛋白，但其免疫原性可在人体内引发严重的免疫排斥反应，从而限制了其进一步的临床研究应用。人源化的报告基因/探针系统能够在一定程度上解决上述问题，同时通过报告基因的多模态显像，能够整合多种分子影像手段的优势，弥补单一影像学方法的不足。
尽管肿瘤细胞免疫治疗的PET报告基因显像具有众多优势，但其前提是免疫细胞均需事先通过体外基因改造来诱导表达报告基因相关蛋白，这一过程可能会影响到免疫细胞的活性和功能。由于活化的免疫细胞是一种处于高代谢状态的细胞，其中众多生化信号通路均会发生改变，若能通过靶向这些通路中的内源性蛋白分子，就不但能够实现免疫细胞的在体直接核素标记及PET显像，还不会影响细胞原有的活性和功能。在自身免疫性脑炎实验小鼠模型中，利用炎性病变浸润活化淋巴细胞的18F-FDG PET显像，实现了脊髓炎性病灶的可视化监测。除了糖代谢之外，核苷酸的补救合成途径也是活化免疫细胞的一个重要代谢特点。18F-氟阿拉伯呋喃糖胞嘧啶（18F-fluoroarabinofuranosyl cytosine，18F-FAC）作为一种新的核苷酸类PET探针，相比于18F-FLT和18F-FDG，在小鼠抗肿瘤免疫模型中，能够更加特异性地聚集于肿瘤组织局部的引流淋巴结，直接优先标记其中浸润的活化免疫细胞，从而实现免疫细胞功能活化的在体无创可视化监测。以上这些均为目前肿瘤细胞免疫治疗PET报告基因显像的研究热点，实现广泛的临床转化应用是其最终目标。
（本文转载中华核医学与分子影像杂志）
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