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蛋白质稳定性的保持

点击次数：  更新时间：2017/2/8 14:08:40  

蛋白质稳定性的保持

实验步骤

一、蛋白质失活的原因

 

在各种条件下使用不同操作方法从细胞环境中提取蛋白质将会导致其活性的丢失和结构的改变。这些操作包括稀释，改变溶液条件，暴露于各种降解酶、氧气、重金属及各种材，的表面，以及生理条件的变化 (如冻融作用) 等。意识到这其中的任何—个情况都有可能影响蛋白质、了解可能采取的尽量减少这些影响的预防措施，都将有助于确保一个纯化草案的成功。如果在任何操作过程中发生目标蛋白质的丢失或失活，那么在确定这种情况发生的原因时将通常会提出一个简单的解决方案。因此，如果可能的话，检查蛋白质失活是否伴随着蛋白质的损失或其结构的变化，或者是否蛋白质仍然存在，但已失活。这些不同可能性之间的区别可能表明了什么类型的操作过程是失活背后的问题，因此也指明了一个适当的解决方案是什么。

 

二、常规处理方法

 

显然，要保持蛋白质的稳定，应避免可以使其变性的处理方法。因此，蛋白质溶液一般不要剧烈搅拌或涡旋，因为这可能会导致蛋白质氧化或表面变性。蛋白质溶液不应暴露于极端的 pH、高温、有机溶剂或任何其他可能促进变性的条件。同样，如果在解冻的状态下长时间储存一种蛋白质溶液，细菌和真菌的生长将会成为一个问题。在这样的情况下，无菌溶液和抗菌或抗真菌试剂可能是必要的。最后，最好使用蒸馏水配制将与蛋白质接触的所有溶液，并且要将蒸馏水储存在无藻类生长的容器中。

 

三、浓缩和溶剂条件

 

从细胞中提取蛋白质不可避免地导致其所在环境的改变。由于蛋白质在体内一般是稳定的，理论上的目标是尝试去复制尽可能接近于细胞的环境，这就意味着高蛋白质浓度、接近中性的 PH、适中的离子强度、还原状态的条件等。实际上，这些条件中有些是与蛋白质纯化相一致的，有些则不是。如前所述，保持高蛋白质浓度 OlmgZmL) 通常是一个很好的做法。这将有助于保持蛋白质复合物的状态，可最大限度地减少有害污染物和表面吸附作用的影响，而且为目标蛋白质提供一个普遍稳定的环境。在蛋白质纯化的早期保持高蛋白质浓度是相对比较容易的，但随着蛋白质纯化的进行，这将变得更加困难，除非在每个纯化步骤之后都进行一次浓缩。因为这些后期的过程通常也存在自身的问题，所以除非特殊的稳定性问题变得很明显，否则在大多情况下，你可能不得不接受稀溶液。将浓缩蛋白质的纯化步骤与稀释蛋白质的纯化步骤进行交替的做法可能是有用的。例如，将结合到层析柱上的蛋白质进行一次性洗脱的操作往往会使蛋白质浓缩，而梯度洗脱则趋向于将其稀释。使用结合蛋白质的层析柱进行纯化趋向于浓缩, 而凝胶过滤则会稀释。通过明智的安排纯化步骤，可能会避免蛋白质溶液被过多的稀释。

 

溶液的条件也是极其重要的。虽然不可能描述出适用于每一个蛋白质的一种通用稳定溶液的配制方法，但对于某种蛋白质来说，添加特定的组分通常是有用的。这些条件包括能够避免不必要的 pH 变化的缓冲体系，体系的 PH 通常在中性附近。应该特别注意缓冲液的阴离子，因为很多情况下 Cr 可能是有害的。EDTA 通常以约 0.Immol/L 的浓度添加，用以螯合可能与蛋白质相互作用或促进氧化的重金属离子。还原剂（如 2-疏基乙醇或二硫苏糖醇) 通常用于对抗氧化作用，尤其是半胱氨酸残基的氧化。可优先使用 0.1?Immol/L 的二硫苏糖醇，因为它不能和蛋白质形成分子间二硫键，而 2-疏基乙醇可以。溶液中应加人足够的还原剂，如果还原剂过少, 蛋白质会在其耗尽后由于失去保护而被氧化。在某些情况下，要加人盐以保持一定的离子强度, 但仅限于当它们与下一步的纯化或分析步骤相兼容的情况下使用。同样,5%?20% 的甘油往往有助于保持稳定, 并且这些浓度适用于大多数纯化步骤。有时，需要加人低水平的非离子去污剂以防止蛋白质聚集或吸附到所使用器材 (如玻璃器皿）的表面。最后，加人蛋白酶抑制剂是一个很好的做法，特别是在早期的操作步骤之中。

 

四、稳定性实验和储存条件

 

在一种新蛋白质的纯化过程中，最重要的研究之一是稳定性和存储研究。这意味着在纯化过程的每个步骤之后，一定要检测感兴趣蛋白质的稳定性和存储性。虽然快捷的蛋白质纯化过程是人们所期望的，但经常会发生一些意外情况，特别是在一个新的纯化过程中，在进行下一个纯化步骤之前需要将蛋白质放置一段时间的时候。为此，你需要知道它在不同储藏条件下的稳定性。最简单的测试办法是取少量蛋白质溶液，将它们存储在不同的条件下 (如储存于冰上、将其冰冻或在室温下存放，以及加人或不加人稳定剂），然后在不同的时间段检测蛋白质的活性。另外，要知道下一个纯化步骤是什么。一些存储条件对稳定很好，但不利于进一步的纯化。一个恰当的例子是于一 20°C 将蛋白质存储在 50% 的甘油 (V/Y) 通常是保持稳定的一个有用条件，但如果你要进行进一步的纯化，这是相当可怕的。有时可能有必要应用这样的程序，即通过透析去除甘油，但这一般是最后采用的解决措施。

 

当你完成了纯化流程并准备长时间存储所纯化的蛋白质时，一个不同的情况出现了。

 

在这里, 主要关注的是蛋白质的长期稳定性，很多在纯化过程中不实用的条件现在变得可用。这些可能包括加人高浓度的甘油、加人稳定性基质, 甚至加入其他蛋白质 (如血清白蛋白）。储存条件的选择取决于什么对蛋白质稳定是有效的，以及纯化的蛋白质将要作何用。如果你主要的兴趣是研究酶的活性，那么血清白蛋白的存在可能无关紧要。相比之下，如果你想要研究蛋白质的结构，那么就不希望有其他蛋白质的存在。如果你不确定，最好是将蛋白质分装并存储在不同的条件下。

 

蛋白质存储的相关问题还有纯化蛋白质溶液的冻融。避免反复冻融的一种方式是将纯化的蛋白质分装成小份，每次按需取出其中的一份或几份融解; 另外，将蛋白质存储在非冻结的条件下，如一 2 〇°C 条件下 50% 的甘油中。如果需要反复冻融, 最好是使用快速的冻融程序。在冷冻过程中，溶质浓缩, 蛋白质可能会暴露于异常恶劣的条件中。我们通常将蛋白质速冻于干冰-乙醇浴以避免这个问题。同样，对解冻蛋白质溶液也应该快速地进行，将其置于缓慢搅拌的温水浴中，直到样品溶解到仅剩少量的冰块时取出。在使用过程中, 溶液解冻后放置于冰上或室温条件下。最后解冻的溶液应该轻轻地混合，如果溶液在管中可以颠倒，以确保溶质均匀分布。

 

五、蛋白质水解和蛋白酶抑制剂

 

蛋白质水解是蛋白质纯化的一个主要问题。因为在很多情况下目标蛋白质在部分降解时仍能保留生物活性，所以这是一个特别潜在的问题。而且这一现象这可能会导致在进行蛋白质大小和结构分析时得出错误的结论。蛋白质水解可能出现在纯化过程的任何阶段。因为纯化过程总是趋向于消除这些具有水解活性的污染物, 所以一般来说总的水解活性在初始的粗提取物中是最高的。然而，粗提物中也存在着很多可能会保护目标蛋白质的蛋白质。在纯化过程中, 一种蛋白酶微量的污染甚至会产生很大的影响，因为大部分可接触的蛋白质底物可能都是你所需的目标蛋白质。

 

如果在特定的情况下蛋白质水解是一个问题，你怎么判断呢？最简单的测试方法是将提取物或部分纯化的蛋白质在温和的温度下孵育 (如 30°C)，分时间段取出部分样品进行生物活性的分析。虽然这种方法并非万无一失，因为可能会有其他原因导致蛋白质失活，但大多数蛋白质在这样的条件下不会热失活。如果活性丧失，建议添加蛋白酶抑制剂，因为在纯化过程中即使是将蛋白质保持在 0?4°C 的条件下也会发生一些裂解，除非蛋白酶灭活。

 

细胞中含有多种不同的蛋白酶类。幸运的是，可用蛋白酶抑制剂作用于各种蛋白酶。

 

表 10.1 列出了一些常用的蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂用于特定的情况或系统在本书其他章节中有所描述。对于一个新的蛋白质最好的办法是使用混合的能够对不同种类蛋白质起作用的蛋白酶抑制剂。这些蛋白酶抑制剂混合物是可以买到的。一旦获得了保持目标蛋白质稳定性的条件, 可以将蛋白酶抑制剂逐一去除以确定哪一个蛋白酶抑制剂是必需的。将会涉及一些反复实验, 以便确定哪些抑制剂是纯化过程所需要的而哪些则不是。请注意，蛋白酶抑制剂在一定条件下是有毒的和/或不稳定的。在没有研究清楚它们的性质之前请不要使用。

 

六、蛋白质活性丢失

 

在蛋白质纯化过程中通常听到的哀叹是:「我的蛋白质失去了活性。」当这种情况发生时，需要仔细分析情况，以查明原因。最重要的是，你应该仔细计算酶单位，以评估活力损失的程度。对于许多纯化步骤，损失高达 50% 的比例是正常的，当然，蛋白质活性损失的情况对每个蛋白质是不一样的。一般来说，包含有将蛋白质与基质结合, 并且在结合的过程中可能需要发生构象变化的纯化步骤相比于凝胶过滤来说对蛋白质活性的影响更大。

 

如果在某一个纯化步骤蛋白质的活性完全丧失，需要考虑其他的可能性。第一种可能是在某些情况下, 蛋白质可能与层析柱结合得非常紧密，需要使用更加极端的洗脱程序。根据层析的类型 (见本书第 6 部分和第 7 部分)，可能需要增加离子强度、使用一个离液序列比较高的盐 (如 KBr)，或在洗脱液中加入去污剂或乙二醇。

 

第二种可能是蛋白质活性的发挥需要多个组分, 这些组分 (如另一个亚基或辅因子）在分级分离过程中被除去了。因此，无论哪一种组分其本身是无活性的，只有在所有组分出现时才可观察到活性。为了测试这种可能性，可将前一步中的所有组分混合到一起，再检测其活性。在某些情况下, 有必要将混合物浓缩到原来的体积去观察其活性。如果混合所有的组分后再次检测到了活性，则应该以配对的方式检测这些组分或组分群。经常会发现某个组分有微量的活性而需要第二种组分以达到最佳的活性。此时，所需要的一种组分已经很明确了，而其他组分可以通过测试其刺激活性来确定。

 

有时在纯化步骤之间蛋白质可能会丧失活性，如在透析或浓缩过程中，或甚至在存储过程中。对于前者，你应该再次检测除去一种可能需要的组分所产生的结果。也有这样的可能性, 就是蛋白质依附在透析管或浓缩膜上。对此，用含有一定去污剂的缓冲液冲洗这些管或膜可能会有所帮助。存储过程中的稳定性问题在上面已经有所讨论。

 

最令人沮丧的情况是以上所有的可能性中没有一种是蛋白质失活的原因。在这种情况下, 最可能的解释是蛋白质因变性、水解等确实失活了。如果可以独立检测蛋白质 (如 WesternBlot 法），这种情况可以直接显示。如果不行，可能需要进行反复实验 (trialanderrorexperiment) 检测各种条件来寻找失活的原因。有时，最好的办法是避免特殊的纯化步骤。

 

少量纯化 (低于毫克级蛋白质量的纯化) 的操作要注意一系列特殊问题。尤其是要特别注意蛋白质因吸附于各种表面而损失的可能性。少量蛋白质与某些表面结合紧密，如玻璃表面和多种塑料表面，常常会高达 Iyg/cm2。在少量蛋白质纯化过程中，由于蛋白质的总量本来就很少，所以这些因吸附而损失的蛋白质的量可占到相当大的比例。当然，你应该避免使用聚苯乙烯材料制成的容器 (如微量滴定盘），因为它具有较高的蛋白质结合能力。在这样的情况下，管道应仔细地冲洗以确保蛋白质的最大回收率。此外，低浓度非离子型去污剂的存在可能有助于防止蛋白质与表面结合。在整个过程中，小心地计算蛋白质的量是相当重要的，这可能会提醒研究者在哪里发生了不必要的蛋白质损失。