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实验动物的灌注固定原理和技巧

点击次数：  更新时间：2017/4/10 9:44:32  

　　灌注固定主要用于神经系统，其他组织意义不是很大，而且耗时耗力。对神经系统防止变性效果较好！

　　小鼠灌注：

　　灌流固定小鼠时我一般采用输液器的针头(4号半，这样肉眼可见就是肺部明显充气胀大变白，针头要从心轴方向进针，刺入心尖3~4毫米左右就可以了，开始灌流后剪破右心耳，约40毫升生理盐水，后再灌流约20毫升多聚甲醛，整个灌流固定的过程就完成了。

　　大鼠灌注：

　　按大鼠体重，用2%戊巴比妥钠（0.25ml/100g）进行腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，向左心室内注射1%肝素钠0.2ml后经左心室行主动脉插管， 血管钳固定后剪开右心耳，先以生理盐水150ml快速冲洗血管，然后用4%多聚甲醛的0.01mol/LPBS（4℃，PH7.40）250ml灌注固 定，先快后慢，共需时间为50min，之后取材，置4%多聚甲醛固定液后固定，在4℃冰箱内保存。多聚甲醛进入大鼠体内，大鼠会出现四肢、尾的抽搐，最终 以肝脏发白、内脏鼓起即灌注好。

　　脑组织免疫组化实验

　　1. 灌注固定用的针头，一般都用注射针头。灌注大鼠一般可用10到12号针头，小鼠可用6、7号针头，但很重要的一点是要把针头的尖端磨钝而不是用锐利的针头。（对不起老板了，把我们的秘密都外传了）。

　　2. 关于穿刺：灌注大鼠时要把穿刺针的尖端插入到升主动脉内，但不宜进入升主动脉过长，在动脉内见到针头或插入约1mm左右即可；灌注小鼠时只要把针头插入左心室内即可，不必要插入到升主动脉内。操作的要点是：第一，操作要迅速，剪开膈肌后，迅速沿腋前线剪开胸壁，并把胸前壁往上翻，暴露心脏；第二，一定要在明视野下操作，要剪开心包壁层的前壁，暴露升主动脉和肺动脉干的根部，确保穿剌针能进入升主动脉；第三，穿刺之前要用适当大小的血管钳夹住心室以固定心脏，但不要夹得过紧，要让心腔内留有一定的间隙，然后在心尖处轻轻旋转针头插入穿刺针。也可以用小剪刀在心尖处先剪开一个小口再插入穿刺针；第四，穿刺方向要正确，从心尖部开始，从左下方斜向右上方，若遇阻力要改变方向再试，不要用力蛮插。

　　3. 灌注用生理盐水的量大鼠用50ml左右，小鼠用10ml左右，一般以从右心耳流出的液体清亮为标准；4%多聚甲醛用量约相当于老鼠体重，如300克的老鼠用300ml左右。小鼠一般用20-30ml。灌注速度先快后慢，可持续1-2个钟头，也可以稍快。取脑后置脑块于4%多聚甲醛内4度后固定4-6个钟头。

　　难点与关键点：

　　将灌注针插入主动脉内是灌注固定的关键，也是难点。首先准确找到主动脉，这是此步骤的要点。可用温生理盐水将胸腔内的血液冲洗干净，用眼科镊子轻轻夹住心 外膜（夹的越少越好，以免影响取材）将心脏向左上方提起，即可看清主动脉，又可使灌注针很容易地插入主动脉内。插入时动作要慢，针尖方向不要偏向右侧，以 免刺入右心房，如果感到有阻力，则将针退后、调整方向重新进针，直到进入主动脉，灌注针进入主动脉后可在心脏的上方看到其位置，灌注针进入主动脉的长度最 好为3~5毫米，然后用丝线扎紧。切勿将灌注针放在左心室内，这样由于主动脉瓣的关闭，灌注液很难进入主动脉，而是沿着心室的切口流出，致使灌注失败。另 外，灌注针插入成功后，一定要用剪刀剪开右心耳而不是右心室，这是灌流液的出口。剪开心尖的位置一定要掌握好，不能偏右使灌注针插入右心室。

　　注意事项：

　　1. 针头大小与动物的种类有关，t同时针头一定要磨钝。

　　2. 检查灌注泵的运作情况，一定排出管子的气泡和空气，防止空气栓塞

　　3. 经腹腔暴露胸腔，先清楚升主动脉外面的脂肪组织和心外膜组织

　　4. 将针头经左心室插入升主动脉（颜色变白的哦），并用钳子固定

　　5. 解开右心耳，同时开启灌注泵。注意，不要随便揭开心脏的其他部位，否则有时候可能会灌注成功但是绝大部分会造成灌注不成功，尤其肺水肿。

　　6. 将4度的生理盐水（最好已动物的肝脏发白为标准，我们实验室的大鼠约用250ml）和多聚甲醛(根据所取得材料而定)依次灌入

　　7. 整个过程均应将动物放在冰上，以便于最大程度的保存目的蛋白和酶的活性。