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超高效电转化细胞的制备、电击及要点——经过实践检验可靠适用

点击次数：  更新时间：2017/8/14 10:52:15  

1.细菌电转化感受态细胞的制备

 

1）由-70度冰箱中保存得菌种划单菌落，过夜培养16－20hr。晚上将将新鲜的菌落接种于2ml-5mlSOB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜，转速控制在180rpm。

2）第二天，取过夜培养物250uL转接入含50ml SOB培养基（1：200）的500mL摇瓶中，37℃剧烈振荡 （300rpm）培养至OD600约为0.72-0.76，将细菌培养物置于冰水混合物中骤冷。

3）用两个预冷的50ml离心管于4℃ 2000g离心10分钟。收集菌体，弃上清。

4）用预冷的水（纯净双蒸水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，先加入少量水重悬菌体，然后把水加满，4℃ 2200g离心10分钟，弃上清。

5）再用10%甘油重复步骤4）两次，2400g离心10分钟，最后一次倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，分装ep管，100ul/支（一般，25ml起始培养物最终用200-250uL10%甘油悬浮）。

6）放入液N2中速冻，保存于－70℃。

 

注意

1） 菌种最好是－70℃冻存的，活化后生长状态较好。

2） 2ml培养过夜，震荡速度不要过高（一般应该是37度，300rpm，6hr，当天转接，这样一天内工作量太大，这里我们选择过夜培养，时间长，转速控制在180rpm, 可以适当缩短时间，前一天晚接种，第二天早转接）

3） 培养完毕后一定要骤冷，使培养物在短时间内迅速冷却。冰水混合物中摇动瓶子，大约10分钟。

4）所使用得器皿一定要非常干净，没有化学物质残存，可以先用餐洗净洗，再加入NaOH固体和蒸馏水产热，最后用蒸馏水反复冲洗干净。注意pH值检测。

5）培养完毕后得离心操作一定要低温，所用的水和甘油，离心管都要冰上预冷。

6）整个过程尽量不要用枪吹打。

7）器皿和试剂最好最后用重蒸水涮洗和配制。

8）控制好菌体的OD600值，我用JM109操作时值为0.727和0.757时都获得非常高效的转化率。而0.83时转化率明显降低。根据季节不同JM109达到相应OD值

所需时间有所差异2.5hr-3hr45min。

9）最后一次务必倒尽上清后，用残存管底的甘油悬浮细胞，一般每管仅剩200uL左右。切务用过多甘油液悬浮细胞，我曾用350-500uL10％甘油/25mL出发菌液，导致细胞浓度下降，电转效率低2-3个数量级。

 

2.电转化protocol1

1） 将电击杯冰上预冷 ，冻存的感受态细胞取出冰上融解

2） 30ul感受态细胞，加入1ul纯化的连接液（或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液），冰上放置60s－90s

3） 将混合液加入预冷的电击杯， 注意擦干杯外的水，防止电火花

4） 3kv，200欧姆，25uF（我们用的是BioRad 电转化仪，0.2电转化杯），时间常数应该在4.5－5ms之间（其值越大，说明感受态细胞中离子去除越彻底。） 电击

5） 加入1ml 37度保温的SOC，将混和液洗出，此步有热击的作用，室温进行

6） 37度震荡培养1－1.5hr，可适当延长时间，使其充分表达抗性

7） 涂板

 

注意

1） 电击之前保持低温状态。

2） 连接液要纯化，去除离子，ddH2O溶；或者加入0.3-0.5uL未纯化的连接液，切务过多以免电火花，我曾试过0.3uL和0.6uL连接液的加入细胞做对比，转化效率相当。

3） 原核生物受体细胞电击以15kv/cm 场强为最佳，电击电压根据电击杯厚度选择

4） 电击杯使用完，用针头蒸馏水反复冲洗杯底，再用70％乙醇浸泡，4度存放，使用前烘干即可。或者烘干后，-20度冰箱存放。

5）37度震荡培养时间切务过长，否则会有很多的卫星菌落和轻微的菌膜干扰。我曾培养1hr45min即出现上述卫星菌落和轻微的菌膜干扰。

 

试剂配制（重蒸水配制）：

SOB：2.0％胰蛋白胨、0.5％酵母浸粉、0.05％NaCl完全溶解搅匀，加入2.5mMKCl 并用NaOH调PH7.0，灭菌后加入过滤除菌的MgCl2备用；

实际配制100mL时：2g bacto－trptone、0.5g bacto－yeast extract、0.05g NaCl完全溶加0.0186g KCl，10N NaOH一小滴即可调至PH7.0 分装入50mL培养基/500mL瓶高压灭菌；此后50mL中加入250uL 2M MgCl2即为SOB培养基；

SOC：50mL无菌SOB培养基+1mL 1M 过滤除菌的葡萄糖即为SOC，分装1mL每管，冻存于-20备用。

10％甘油：用分子生物学级别的甘油。