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第一章：掌握这 8 点令 PCR 引物设计事半功倍

点击次数：  更新时间：2017/8/14 12:43:05  

临门一脚，先讲核心，掌握核心，引物设计任你驰骋。

 

引物长度

引物长度对反应特异性、解链温度、退火时间都有较大的影响，最终影响到 PCR 反应 是否成功。多数情况下，引物长度约 18~30bp, 引物太短会导致非特异扩增，太长虽然会增加特异性，但是二级结构（如发夹结构）出现的概率增大。

 

引物的解链温度

PCR 反应的特异性很大程度上依赖于引物的解链温度（Tm 值）。多数 PCR 反应最优的 解链温度应在 55~60℃，如果没有其他不稳定因素，引物的 Tm 值取决于它的长度、序列组成和浓度，离子强度的影响可以忽略不计，因为不同的 PCR 反应盐浓度变化不大。

 

一个反应中所有引物的解链温度应尽可能接近。对于多数 PCR 反应而言，引物之间的 差应小于 2~3℃。差值增大，反应效率会降低，甚至直接导致反应失败。因为 Tm 值髙 的引物在低于退火温度的条件下错配，而 Tm 值低的引物在髙于退火温度的条件下与模板只 有低浓度结合。

 

可利用以最近邻热力学理论为基础的公式估算 Tm 值，该理论分析了复式解链的热力学过程。

 

Tm = [△H/△S-RIn(c)]-273.15（公式 1）

复式构成物中焓变（△H）和熵变（△S ）可借助于最近邻热力学参数计算，为摩尔气 体常数，c 为寡核苷酸的物质的量浓度。该分析可确定特定的焓和熵对复式构成物的自由能 的影响，该影响由序列中的「最近邻」造成。最近邻从 5' 末端起始，焓和熵的效应是加性的。在式（1）中加人另一个条件，以经验性地计算盐对复式构成物的稳定性的影响。

Tm =[△H/△ S + R In(c)] - 273.15 + 12.0lg[Na+] （公式 2）

大多数引物设计软件都使用 Breslaner 或 SntaLucia 最近邻参数系统估算寡核苷酸复式构成物的 Tm 值（Breslauer et al. 1986; SantaLucia 1998)。

对于由 20 个或更少个碱基组成的短序列，可用 Wallace 原理计算其第一位近似值。该 公式假定盐的浓度为 0.9 mol/L，这是斑点杂交分析的常用浓度。

Tm = 2℃ * (A + T) + 4℃ * (G + C) （公式 3）

一般来说，退火温度比引物解链温度低 5°C。但是，根据这一原则得出的退火温度常常 并不是最优的，必须通过实验获得最优温度。利用梯度热循环仪很容易实现这一目的。另外，可利用更精确的公式计算乃值（最优退火温度）（Rychliketal.1990)。

Ta = 0.3 * 引物 Tm 值 + 0.7 * 产物 Tm 值 - 25 （公式 4）

 

复制子的解链温度

除了计算引物的解链温度以外，还要保证产物的解链温度要足够低，以保证其在 92℃ 时完全解链。一般来说，100~600bp 的片段可以有效扩增。该参数有助于使 PCR 效率更高，但并不总是成功的 PCR 所必需的。产物的 Tm 值可根据（式 5） 计算。

Tm = 81. 5 + 16. 6*(lg10[K+])+0.41(%G+C) - 675/长度 （公式 5）

 

二级结构

设计引物时，另一个需要考虑的重要因素是二级结构的存在。一个带有自身同源序列的引物可以回折形成部分双链的发夹结构。类似地，引物之间的同源可能引起引物二聚体的形 成。PCR 反应时，相对于模板而言，引物浓度髙很多，引物之间相互退火要比引物与模板 之间退火容易得多。因此，引物如果存在发夹结构或者二聚体，对于 PCR 扩增往往 是致命的，因为这样会导致非特异的大量背景产物的扩增。避免出现二级结构的最简单的方 法是：选择 GC 含量约 50%、四种碱基中缺少一种的引物。

重复

同一碱基或几个核苷酸的重复也应尽量避免。不同的重复对 PCR 反应的影响见表 1。

GC 夹

在引物的 3'端包含一个 G 或 C 残基可增加引物扩增效率，这就是所谓的「GC 夹」。它 可以促进引物的 3'端正确地结合到模板，因为 GC 夹可以形成更为稳定的氢键，因此可以提髙扩增的特异性。以胸腺嘧啶结尾的引物的特异性有降低的趋势。

 

高 GC 含量片段的扩增

为了扩增高 GC 含量的 DNA，应该设计 Tm 值（最好为 75~80℃) 较高的引物。髙 GC 含量的 DNA 双链完全解开所需的温度明显较一般的 DNA 高。温度较低时，PCR 复制子的两条单链有较快地重新退火的趋势，可与引物退火相互竞争。因此，PCR 过程中退火温度较髙有助于引物退火，因此可以提髙扩增效率.

（本文转载丁香通）