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免疫共沉淀与Western Blot

点击次数：  更新时间：2017/8/14 13:53:19  

实验步骤:

1．以60mm 细胞培养皿为例，细胞转染后24－36 小时后，吸净培养液（可用PBS

小心漂洗一次）。

2．加入500μl 预冷的1×lysis buffer, 于4℃或冰上放置裂解细胞5 分钟。

3．将细胞裂解液转移到1.5 ml eppondorf 管内，于冷冻离心机4℃，13000 g 离心30

分钟。

4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer, 混匀后于100℃煮10 分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10 μl 进行SDS－PAGE 电泳，Western blot 检测目的蛋白的表达水平（接第5 步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下：

1） 分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5 μl Agrose A/G beads及5 μl（1 μg）抗体计算一次实验所用beads 及抗体的总量，将抗体和beads 混合，补充lysis buffer （补充的lysis buffer 的量能使每管能均匀分配到50 μl beads及抗体的混合物），将beads 及抗体的混合物按每管50 μ（l 含5 μl beads 及5 μl 抗体）分配到1.5 ml Eppendorf 管中，再加入400 μl 1×lysis buffer，备用；

2） 从步骤4 中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400 μl 加入到上一步（步骤1））已分好的beads 中，使终体积达到850 μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15 rpm）免疫沉淀3 小时；

3） 将免疫沉淀后的溶液于4℃ 3000 rpm 离心3 分钟，去上清，加入500μl1×lysis buffer 洗涤beads，于冷冻离心机4℃ 3000 rpm 离心3 分钟，弃上清，共洗涤三次。

4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35 μl 1×lysis buffer 与等体积2×SDS sample buffer 混合，于100℃煮沸10 分钟，稍离心后取10μl 左右上样到PAGE 胶，进行电泳，或－20℃冻存。

5．电泳完毕，取下PAGE 胶，与PVDF 膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1小时。

6．电转完毕，取下PVDF 膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75 rpm）封闭1 小时以消除非特异背景。

7． 封闭完毕，用TBST 洗掉牛奶，加入一抗，于脱色摇床摇荡孵育（75 rpm）1小时，使一抗与特异蛋白结合。

8． 回收一抗，用TBST 洗3 次（75 rpm），每次5－10 分钟。

9． 加入二抗，于脱色摇床孵育1 小时，使二抗与一抗结合。

10．用TBST 洗3 次，每次5－10 分钟。

11．将ECL A 液和ECLB 液各1ml，混匀，放入二抗孵育后的PVDF 膜30 秒，将PVDF 膜平铺于曝光盒中，进暗房，用医学X 光胶片曝光。

12．经过显影、定影后的胶片，于室温下自然风干或烘干，描画蛋白marker 便于分析。

注：如只做Western Blot，跳过步骤4 即可。

实验试剂：

1．PBS：NaCl 20mM, KCL 2.68mM, Na2HPO410mM, KH2PO4 1.76mM (pH7.4)，室温保存。

2．1×lysis buffer：Tris-HCl 20 mmol/L(pH7.5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, TritonX-100 1%, Sodium pyrophosphate 2.5 mM, β-Glycerrophosphate 1 mM, NaVO41 mM, Leupeptin 1 ug/ml,－20℃保存。（稀释成1×lysis buffer 后加入1 mMPMSF ）

3．2×SDS sample buffer：Tris-Cl（pH 6.8）125 mM，SDS 4%，甘油20%，DTT 100 mM，溴酚兰0.02%，室温保存。

4．分离胶（下层胶）（10% SDS-PAGE）15 ml：30% 丙烯酰胺5 ml，10×lower buffer (pH 8.8) 1.5 ml，H2O 8.5 ml，10% AP 15μl，TEMED 15 μl。

5．10 × lower buffer (pH 8.8) 100 ml：42.25 g Tris base，10 ml 10％SDS，室温保存。

6．压缩胶（上层胶）（4 % SDS-PAGE）5 ml：30% 丙烯酰胺0.65 ml，4×stacking buffer (pH 6.8) 1.25 ml，H2O 3.05 ml，10%AP 5 μl，TEMED 5 μl。

7．4 × stacking buffer (pH 6.8) 100 ml：6.06 Tris base，4 ml 10％SDS，室温保存。

8．电泳缓冲液：Tris base 0.125 M，甘氨酸0.96 mM，SDS 0.5%，室温保存。

9．电转缓冲液：Tris 25 mM，甘氨酸0.2 mM，甲醇10%，室温保存。

10．10×TBS (pH 7.6)：Tris base 2.42%，NaCl 8%，室温保存。

11．TBST：1×TBS，Tween-20 0.1%，室温保存。