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体外DNA重组技术-- DNA酶切，电泳分离与片段的回收

点击次数：  更新时间：2017/8/14 14:50:27  

 DNA酶切，电泳分离与片段的回收

【实验目的】

掌握常用限制性内切酶的作用特点以及使用方法。

掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的操作与DNA片段的回收。  

【实验原理】

目的DNA被限制性核酸内切酶水解后产生大小不同的DNA片段，这些DNA片段在一定浓度的琼脂糖凝胶电泳上可以按分子大小不同而分开，并可以用不同的方法再把这些DNA片段从琼脂糖凝胶上回收回来。  

 限制性核酸内切酶水解DNA的活性与酶的单位数，缓冲液的离子强度和反应温度有关。

【实验试剂与器材】

限制性内切酶

10×内切酶缓冲液

琼脂糖

（一）DNA分子的酶切消化

【实验方法与步骤】

DNA分子用限制性内切酶消化，通常按下列比例进行：

     

双蒸馏水                       适量

     

10×内切酶缓冲液           1/10体积

    

 DNA                        1μg

限制性内切酶            1/10体积 (DNA用1-10U)

总体积 混匀后37℃温育30～120min

（二）DNA酶切片段的琼脂糖凝胶电泳

【实验原理】

核酸在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。琼脂糖凝胶具有多孔的网状结构，以其为介质进行电泳时，不同大小的核酸可借凝胶的分子筛作用而得以分开。用溴化乙啶染色后，在紫外灯下，可见橘红色的核酸条带。琼脂糖凝胶常制成水平平板状，电泳缓冲液覆盖在平板表面，加样后，通电进行电泳，故称为潜水式电泳。

【实验试剂与器材】

1. ５×TBE: 54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，配1升。

2. 0.5xTBE: 取5×TBE 作10倍稀释

3. 溴化乙啶液： 10mg/ml水

4. ６×载样缓冲液： 0.25%溴酚蓝，40%(W/V)蔗糖水溶液

【实验方法与步骤】

1. 铸胶 1g琼脂糖加0.5xTBE缓冲液100ml，在微波炉上加热融化，冷却至放在手背不觉烫手（约50℃）后，倾入架有样品孔形成器（梳子）的微型水平电泳槽中。胶液固化后，倒入0.5xTBE至高出胶面1～2mm，拔出梳子，接好电源线（注意正负极）。

2. 加样  核酸样品中加入样品体积1/6的6x载样缓冲液，混匀后，用移液器加入样品孔内。

3. 电泳　接通电源，施加的电压应小于5v/cm，待溴酚蓝跑至适当位置时，关闭电源。

4. 染色和结果观察   向微型电泳槽内滴加溴化乙啶液，至终浓度约为0.5μg/ml，混匀后放置约30min，在254nm紫外灯下观察电泳结果，做好记录。

【注意事项】

1. 溴化乙啶是致癌剂，并有中度毒性，实验中要戴防水手套，不要污染环境。紫外灯下观察结果时，应戴防护眼镜。

2. 也可将溴化乙啶预先加入琼脂糖中，使浓度达0.5μg/ml进行配胶。

3. 琼脂糖的浓度一般用0.8%~1.2% ,可随欲分离核酸分子的大小作调整，分子大用低浓度凝胶，分子小用高浓度胶。分离RNA时要用变性胶。

（三）DNA酶切片段的回收

【实验方法与步骤】

1. 冻融法:

（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，-70℃冷冻至少15min，然后在65℃水浴中使胶融化；

（2）加入等倍体积TE-饱和酚，剧烈振荡30秒钟，然后-70℃冷冻15min；

（3）室温融化后，12,000rpm离心5min，将上层水相移至另一离心管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA片段，离心后的沉淀用75%乙醇漂洗一次，室温干燥DNA，用双蒸水或TE缓冲液溶解DNA后，-20℃保存备用。

2. 低熔点琼脂糖法:

（1）在UV灯下，用手术刀片在待回收DNA片段前方挖一槽，然后用同样浓度的低溶点琼脂糖将槽填平，继续电泳至待回收DNA片段进入低熔点琼脂糖中；

（2）在UV灯下，用手术刀片将含DNA的低熔点琼脂糖凝胶切下，37℃水浴10min至凝胶融化为止；

（3）加入等体积的TE饱和酚/氯仿(1:1)抽提，12000rpm离心5min；

（4）将上层水相移至另一离心管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉出、75%乙醇漂洗一次，晾干备用。

3. DNA回收试剂盒（玻璃乳法）:

（1）在UV灯下，从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的凝胶，放入一离心管中；

（2）加入3倍体积的6mol/L NaI溶液，45～55℃水浴5～10min使胶完全融化；

（3）加入10?滋l玻璃乳悬液，轻弹管底混匀，然后45～55℃水浴5～10min，期间每2～3min混匀一次；

（4）5000rpm离心30~60秒，弃上清；

（5)加400?滋l漂洗液（20mM Tris.Cl，pH7.4/1mM EDTA/100mM NaCl和等体积无水乙醇），轻弹管底混匀，然后同上离心弃上清；

（6）再加入漂洗液，轻弹管底混匀，然后同上离心弃上清，并用加样器尽量除净漂洗液，然后室温晾干；

（7）加10~30?滋l无菌双蒸水或TE缓冲液将玻璃乳悬浮起来，45～55℃水浴5～10min；

（8）10000rpm离心1～2min，回收上清备用。

【注意事项】

漂洗玻璃毛时不可用加样器上下吹打，从玻璃毛上洗脱DNA时则相反。