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蛋白质检测--SUMO

点击次数：  更新时间：2017/8/14 15:00:01  

1.SUMO背景介绍

SUMO化修饰与一些重要疾病相关联。SUMO 化能影响淀粉样前体蛋白产生淀粉样β肽(A β),其机制尚不清楚。过表达SUMO23,诱导SUMO化 蛋白增加可抑制ʌβ的产生,过表达SUMO232K11R (其参与形成多SUMO链的赖氨酸残基敲除)则可 产生相反的效应,说明单SUMO化可增强ʌβ的形成,而多SUMO化则抑制ʌβ的形成。多聚谷氨酸(polyQ)重复扩增可引起何杰金氏病(HD)、脊髓小脑共济失调、Machado2Joseph病和 延髓脊髓性肌萎缩等神经退行性疾病。研究显示,患这些疾病的患者受损脑区神经元SUMO21染色增强,说明SUMO化修饰也参与调节polyQ的重复扩增。应用HD果蝇模型证明Huntingtin(Htt)的polyQ区的一个片段,既可被SUMO化,又可被泛素化。泛素化可消除神经退行性变,然而SUMO化则可加剧神经退行性变。SUMO化的Htt稳定,不易聚集,具有较强的抑制转录能力。SUMO化促进可溶性毒性Htt寡聚体的聚集,通过抑制转录而 介导神经退行性变。

2.SUMO基因重组质粒的转化及扩增

（1）取10ngSUMO基因重组质粒，加入50ulDHα或JM109感受态细胞。

（2）冰浴30min    42℃水浴，热休克60-90s    冰浴5min。

（3）在试管中加入950ul不含抗生素的LB培养基，37℃恒温摇床220rpm振荡孵育40-60min。

（4）4℃4000g，离心2min收集细胞。

（5）取20ul菌液放入含抗生素LB琼脂糖平板，将细菌均匀涂至整个平板表面。

（6）37℃恒温培养箱中培养16-24h。

（7）试管中加入2-5ml含抗生素的LB培养基，挑取单克隆菌落放入试管。

（8）37℃恒温振荡培养过夜。

3.SUMO质粒DNA的提取

（1）用1.5ml离心管取少量菌液，离心后弃掉上清液。

（2）用250ul P1溶液重悬菌株，漩涡振荡使菌液重新完全悬浮。

（3）加入250ulP2溶液，轻轻涡旋4-6次混匀。

（4）加入350ulN3溶液，轻轻涡旋4-6次混匀。

（5）13000rpm（或17900×g）离心10min。

（6）用移液枪轻轻吸出上清放入QIAprep spin柱中，放置1-2min。

（7）13000rpm离心30-60s，弃滤液。