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荧光原位杂交（FISH）技术

点击次数：  更新时间：2017/8/14 15:25:25  

FISH简介

是一种简单、敏感、而容易操作的方法，结果迅速，并能在同一标本上检测多个不同的基因，可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。

FISH技术是利用特异的DNA探针，标记了生物素，地高辛、或荧光素，对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交，并用荧光法显示，对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

FISH实验步骤

试剂配制：

（1）变性液（70%甲酰胺 + 2×SSC，pH7.0）：4 ml 20×SSC；8 ml 蒸馏水；28 ml 甲酰胺。每次新鲜配制。

（2）杂交后洗涤液： 20×SSC 4 ml；蒸馏水16 ml；甲酰胺20 ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。

 

1.  用硅化玻片，石蜡切片，60℃烤片过夜。二甲苯脱蜡至酒精，斜置切片，空气中干燥。

2.  蛋白酶处理：

（1）每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

（2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。

（3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。

（4）梯度酒精脱水（-20℃预冷），空气中干燥。

3.  变性：

（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；

（2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；

（3）78℃孵育8 min；

（4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2 min；

（5）空气干燥。

4.  杂交：

（1）准备探针；

（2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

（3）滴10 μl 探针在切片的组织上，加盖玻片；

（4）盖上湿盒盖，37℃孵育12~16 h。

杂交后水洗：

（5）镊子小心去除盖玻片；

（6）43℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min；

（7）2×SSC（37℃）洗两次，每次10 min；

（8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

检测：

（9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

（10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20 min；

（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2 min。

扩增：

（12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

（13）每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20 min；

（14）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2 min；

（15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

（16）每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20 min；

（17）1×PBS室温下洗3次，每次2 min。

5.  细胞核染色：

（1）张切片加10~20 μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5 ml；

（2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。