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降低 MTT 法实验过程中各种影响因素的方法

点击次数：  更新时间：2017/8/15 13:31:29  

MTT 原理

MTT 全称为 3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原 MTT，同时在细胞色素 C 的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以经溶剂溶解后用酶标仪在 570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度 OD 值间接反映活细胞的数目。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

MTT 法的实验操作步骤看似简单，但在学习的过程中才发现，要想得到可信而漂亮的检测结果并不是那么容易。在不断的摸索和老师的指导下，终于得到了满意的结果。在这里，我对该实验具体操作中遇到的问题进行了归纳总结。

影响因素及解决办法：

一、影响复孔重复性的因素：

MTT 法通常是在 96 孔板中种上细胞，然后分不同的组给药，设置对照组，以检测药物对细胞的增殖影响。设复孔的目的是对实验结果可信度的一个有效监测办法。因为复孔间的差异越小，说明操作越精确。结果的可信度也越高。那么是哪些因素影响复孔的重复性呢？

首先，应该是孔间细胞是否均匀，只有在每孔的细胞数量尽可能一致的情况下才能建立起后续试验的可信基础。保证细胞种得均匀主要靠熟练的操作，细节上是在种板的过程中，每种 5 到 6 个孔需将细胞悬液吹打几次，因为细胞在重力作用下有下沉的趋势。一般我们是设 3~6 个复孔，竖行排列，这样方便种板和计算。可能的情况下，多些复孔检测作用会好些。

其次，是“边际效应”，96 孔板放在 37℃ 孵箱中孵育细胞的过程中，周边孔内液体容易挥发，测定数据与中心孔有较大出入，所以周边一圈通常不种细胞而只加 PBS, 另外得注意保持培养箱的湿度条件。

二、影响加药组与对照组间可比性的因素：

要得到不同药物组对细胞的抑制或促进增殖率，就必须用加药组与对照组进行比较，以对照组为基准。如果对照组的细胞出现不好的生长状态，实验结果将受到影响。

首先，细胞的接种密度不能高，要根据实验性质和实验检测的时间长短来确定所种细胞数量。通常细胞增殖实验每孔加约 2X103 个细胞，细胞毒性实验每孔加约 5X103 个细胞。具体还要根据细胞的大小，细胞的增殖速度来定。如果检测的时间长，细胞密度还得减少。我们在检测加药后 120 小时抑制率时所种细胞密度为每孔 800 个细胞。但在加药 72 小时后镜下的对照组开始由于拥挤增殖减慢，到 96 小时和 120 小时细胞因太密而部分死亡，而小剂量药物组反而因前期的抑制作用使细胞拥有足够的空间，出现相对增殖加快。这就造成抑制率降低甚至负抑制率的假象出现。因此，所种细胞的密度应以保证培养终止时细胞不出现过满为准。这就需要在做 MTT 实验前对每一种细胞就其贴壁率、倍增时间和不同接种细胞数的生长曲线来确定所种细胞密度。

另外需要注意的是药物溶媒，许多溶媒对细胞的生长都有影响，如无血清培养基、PBS、DMSO、无水乙醇等，所以对照组中一定要加入与药物组工作液相同体积的溶媒；而不同加药组的工作液体积也要保持相同，并且比例不要过多，这样才能更准确的反应结果。我们所用药物是水溶性的，所以选择了对细胞影响较小的无血清培养基，工作液体积不超过总体积的 1/4，也就是 200ul 总体积中加 50ul 的工作液。

三、加 DMSO 前吸取上清要避免甲臜的丢失、加 DMSO 后需充分震荡，保证时间的一致。

通常甲臜的溶解液选用 DMSO，在加入 0.5%MTT 孵育 4 h 后，吸弃上清然后加入 150ulDMSO。在吸上清时我们用一次性注射器，针口斜面对着孔壁，针尖沿孔壁落底后不再移动，一手扶住培养板，让板微微倾斜，一手握持注射器，用拇指和食指推动活塞匀速抽吸液体。这比用枪头或直接倾倒好操作，甲臜的丢失也会减少。

加入 DMSO 后需让板在震荡器上振 10~15 分钟，充分溶解甲臜。注意前后试验时间上的一致性。

四、溶剂的生产厂家、化学级别、批次

要保证 DMSO 在同组试验中的生产厂家、化学级别、批次的一致。