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总RNA的提取方法

点击次数：  更新时间：2017/8/9 16:18:48  

总RNA的提取方法

总RNA提取

具体步骤：（关键是防止RNA酶的污染）

⑴标本

1) 称取-85℃冰冻保存的标本50-100mg，于液氮中夹碎(用剪刀将组织块剪成若干碎块)(须避免RNA酶的污染)。

2) 将组织碎块加入1ml TRI zol变性缓冲液中(所加组织块的体积不能超过TRIzol体积的10%)，在玻璃匀浆器中充分研磨至无明显大的组织块为止，研磨过程在0℃冰水中进行，以防止组织RNA被降解。

⑵ RNA的分离

3) 然后将组织匀浆液转移到1.5ml的Eppendorf管中，室温静置5min，使核蛋白复合体完全分离。

4) 加入0.2ml的氯仿，盖紧盖子，充分摇匀15秒左右，配平，室温静置2-3min 。

5) 4℃冰冻离心机中离心(12000g/min，15min)。此时可见液体分层：底层——红色酚-氯仿相；中间层——粉红色的交界相；上层——无色液相（RNA全部在此相中）。

⑶ RNA的沉淀

6) RNA仅存于上清中。将上清转移至新管（1.5ml的Eppendorf管）中(切勿将中间层误吸入)，

7) 加入0.5ml的异丙醇，充分混匀，配平，室温静置10min。

8) 4℃冰冻离心机中离心(12000g/min，15min)。

9) 弃上清(动作轻，慢)，在管底部可见一乳白色小沉淀物，即为RNA。

⑷ RNA的清洗  

10) 加入1ml 75%乙醇，混合震荡，（可在2℃-8℃中保存一周，－15－25℃中保存一年）

11) 4℃冰冻离心机中离心(7500g/min) 5min，弃上清。

⑸ RNA的再溶解

12) 通风，室温中干燥5min-10min，让乙醇挥发（根据肉眼观察管内水分情况，不能太干，RNA干后难溶解）。

13) 加入10ul的0.1%的DEPC处理水溶解RNA。

14) 供下一步实验使用或-70℃冻存。

RNA完整性的检测（应用检测DNA完整性的方法进行）：

1) 电泳槽的处理：

做RNA电泳时先用肥皂水洗净，无水乙醇冲洗，自然干燥后用3%双氧水浸泡15分钟，再用DEPC处理水冲洗即可。

做DNA电泳时，先用肥皂水洗净，无水乙醇冲洗，自然干燥后即可使用。

2) 配置50*TAE缓冲液

50×TAE配方:

Tris 24.2 g

冰乙酸 5.71 mL

0.5mol/L EDTA (pH8.0) 10mL -------1.861 g--------NaOH调节PH值到8.0 分子量372.24*0.5*0.01＝1.861 g

加DEPC处理水 加至1 00mL 应用时用DEPC处理水稀释50倍使用

3)制备凝胶（1%琼脂糖凝胶）

称取琼脂糖300/500mg，加入1×TAE 30/50ml中，微波炉加热至融化（中火1分钟），冷却至60℃，加入EB嗅已啶（10mg/ml）1.5 /1.8ul,混匀，倒入电泳槽中，室温30分钟以上至凝固，最终配成浓度为1%琼脂糖凝胶。

4)加2 μl 灭菌的并经用DEPC处理的加样缓冲液于10μLRNA样品中，混匀后加样于1%琼脂糖凝胶加样孔中。

加样缓冲液配方：

50％甘油 5ml

1 mmol/L EDTA(PH值8.0) 20ul

0.25%溴酚蓝 25mg

0.25%二甲苯青FF 25mg

5) 在1%的琼脂糖凝胶上进行水平电泳，电压5V/cm,电泳时间约40分钟。

6)在可见/紫外线检测仪254nm紫外光透视下，对结果进行观察。应可见真核细胞核糖体RNA中的28s 和18s RNA 两条清晰条带。所得结果用相机拍摄存档。

个人心得：

研磨组织时用研钵，研钵需事先180度烤8小时，待晾凉后备用

研钵需用液氮预冷，保证研磨组织过程低温操作，最好在液氮中把组织研碎，然后加入TRIZOL提取液（最好为国外进口试剂PROMEGA较好）