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FITC标记抗体的方法

点击次数：  更新时间：2017/9/7 14:58:36  

一、FITC的特性

异硫氰酸荧光素（FITC）呈黄色、橙黄色或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存两年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为398.4.

在碱性条件下（pH8.5以上），FITC的异硫酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个Ig分子上最多能标记15~20个FITC分子。

二、FITC标记抗体的方法

FITC标记抗体的方法为Marsshall法，其材料和方法及步骤如下：

  

1、材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25~50mL）、冰及冰槽（或1000mL烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透吸袋、玻棒、棉线及烧杯（500mL）、pH7.2或pH8.0的0.01mol/L PBS等。

2、方法及步骤：

抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度的溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/mL，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5~10min。

荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角瓶壁或搅拌玻璃棒上（大约5~10min内加完）。加毕后，继续搅拌12~18h。结合期间应保持蛋白溶液于4摄氏度冰箱或冰库中。

透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500rpm）20min，除去其中少量的沉淀物，装入透吸袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0~4摄氏度）过液。

过柱：取透析过液的标记物，过葡萄糖凝胶G-25或G-50柱，分装、贮存于4摄氏度冰箱或冰库中。

三、荧光抗体的保存

以0~4摄氏度或-20摄氏度低温保存，防止抗体活性降低和蛋白质变性。最好加入浓度为（1:5000）~（1:10000）的硫柳汞或（1：1000）~（1:5000）的叠氮钠防腐，小量分装如0.1~1mL，真空干燥后更易长期保存。