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拟南芥幼苗蛋白免疫共沉淀实验步骤

点击次数：  更新时间：2018/1/24 13:56:01  

拟南芥幼苗蛋白免疫共沉淀为例详解实验步骤：

1、 拟南芥幼苗在液氮中充分研磨

2、 将粉沫转入到预先加入了3倍体积的细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)小烧杯中 , 冰上轻轻搅拌，让其在冰上融化，后转入离心管中，4℃，13000rpm离心20min，上清转移至新管

3、 加入1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads， 轻轻转动4℃孵育1h

4、 4℃，4000rpm离心5min , 将蛋白抗体磁珠复合物离心至管底，弃上清

5、 用裂解缓冲液清洗两次，弃去上清，最后一次上清一定要尽量去干净

6、 加入45ulLSDS loading Buffer，沸水中煮5min , 冷却到室温后离心，上清液进行SDS-PAGE，WesternBloting及下游实验检测。

注意事项：

1、 样品处理的质量决定抗原抗体反应中抗原的质量，需要控制所有操作在冰上或4℃；

2、 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，防止蛋白降解。多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100）。针对不同的实验目的和蛋白质特性选择不同的裂解液。

3、 实验时需要使用对照抗体包括阴性和阳性，阴性对照一般是同种属的IgG，阳性对照可以选用已知的细胞内某种蛋白抗体。