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攻克“免疫共沉淀”,没点儿套路怎么行?(一)

点击次数：  更新时间：2018/1/5 15:15:07  

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。因其具有可信度高的优点，在现在基础医学研究中广泛应用。

1.基本原理

抗体与抗原形成特异的免疫复合物。当细胞在非变性条件下被裂解时，细胞内的许多蛋白质与蛋白质间的相互作用被保留了下来。当裂解液中加入蛋白质A的特定抗体，免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。经过洗脱后收集免疫复合物 ，再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting检测，进而证明两者间的相互作用。

2.免疫共沉淀抗体的选择

抗体可以选择多克隆抗体和单克隆抗体，各有优点和缺点。多抗与抗原有较高的亲和性，多抗的多个结合位点可 以有助于形成稳定的抗原，抗体蛋白复合物 。单抗的优点是特异性好，缺点是亲和力差 , 当亲和力小于一定程度时，单抗很难用于免疫共沉淀技术，并不是所有的单抗都适用于免疫共沉淀反应 。

CO-IP应用广泛，可以验证蛋白复合物的存在，也可以用于发现新的蛋白复合物，在肿瘤研究、病毒研究、各种细胞信号传导通路研究等方面广泛应用。

3.免疫共沉淀技术的优点与不足

在检测蛋白质相互作用的过程中，免疫共沉淀是在不添加任何其它成分的细胞裂解物中发生的，该方法有以下优点：

1、检测产物是蛋白质的粗提物。

2、抗原与作用蛋白在细胞中浓度相似 , 避兔了过量表达造成的人为效应。

3、蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在，复合物以天然状态存在 , 蛋白的相互作用可在天然状态下进行，避免人为影响，得到天然状态下相互作用的蛋白复合体 。

但是此方法亦有其局限性：

1、必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果，单有可能发现新的蛋白复合物。

2、免疫共沉淀所得的蛋白质有可能不是直接相互作用的蛋白质，而是通过第三者间接相互作用的蛋白质。

3、由于细胞在不同的时间和条件下含有不同的蛋白质组分，所以我们得到的蛋白质可能只是在某个时期与靶蛋白相互作用的蛋白质，在分析时要注意用于免疫共沉淀的抗体不是总是与操作相合适。