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探针的选择与标记

点击次数：  更新时间：2018/6/13 14:13:25  

1.探针选择

特异性的探针必须是一段已知的基因片段。相对于膜上杂交而言，原位杂交有特殊性。即细胞和组织中的待测基因隐藏于类似于网络状的立体结构之中，给探针的进入带来明显的影响。探针能接触到靶分子对原位杂交尤为重要。理想的探针应满足下列要求：适当的探针长度。‚能对探针进行高效率的标记。ƒ能长期保持稳定。核酸探针多种多样，基本上可分为DNA、RNA和人工合成寡核苷酸三大类。

a.DNA和RNA探针

      其原理是克隆一段特异的DNA或RNA片段，装载到相应的质粒中。经过质粒扩增，酶解和纯化等步骤，就可以得到大量的DNA和RNA片段。更好的解决办法是直接购买纯化好的探针，其次是获得一装载好特异性DNA或cDNA片段的质粒。目前在国际国内都有商品化的DNA探针供应，这些探针已经严格纯化和定量。

b.寡核苷酸探针

在待查基因序列已知的情况下，简单而又经济的用途是合成寡核苷酸探针，寡核苷酸探针的长度一般为10-100bp，探针越短，渗透性越好，但结合不太稳固。探针越长则合成成本上升，也没有必要。最好是长度20-30bp的寡核苷酸探针。合成探针的时候可以掺入半抗原如地高辛、生物素和FITC等。寡核苷酸探针也可用3′末端标记法予以标记。

2.探针标记

      各种不同类型的探针需要经过恰当的标记，才能在原位杂交中应用。DNA探针一般采用的标记方法为随机引物标记和缺口平移法。寡核苷酸探针则主要采用3＇末端标记。目前标记方法分为放射性核素标记和班抗原标记两种（包括生物素）。放射性核素标记的优点是敏感性特别高，特异性也比较好。缺点是药有放射性核素有关的处理经验，存在着对人体的潜在危害性，班抗原标记的典型代表是地高辛、FITC和生物素。其最大的优点是没有放射性核素的潜在危害性，同时也有较高的敏感性和特异性。