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抗原-抗体反应

点击次数：  更新时间：2018/6/13 14:41:48  

1 仪器和设备

塑料盒、振荡器。

2 封闭

一般采用5%脱脂奶粉进行封闭，室温，30-60min。

*封闭液的浓度可以是（1%-5%），根据自己的条件摸索浓度就可以。

封闭液的配置除了PBS-T液之外也可以使用TBS-T液或10mmol/L Tris-HCL(PH 7.4)溶液。

3 一抗的处理

（1）一抗稀释倍数：根据样本和抗体的种类不同，预实验寻找选择最适稀释倍数。

（2）一抗孵育时间：一抗的孵育时间是从几个小时到过夜不等，建议使用较高较高的稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。一抗过高会产生非特异性条带。

（3）一抗孵育时间：尽可能低温孵育，特别是磷酸化一抗过夜时应在4℃进行，否则会产生污染而破坏磷酸化蛋白。

*孵育一抗最好在摇床上进行，防止结合不均匀。

4 二抗的处理

（1）常用二抗：HRP偶联二抗。也可用碱性磷酸酶标记二抗，但不够灵敏。

（2）二抗稀释液：PBS/PBS-T液、TBS/TBS-T液、一般的封闭液等。

（3）二抗稀释倍数：根据二抗说明书推荐倍数稀释二抗。也可按1：100-1：20000常规稀释倍数进行预实验选择最适稀释倍数。如二抗的浓度过高可导致非特异性条带。

（4）二抗孵育时间：一般室温孵育1h。

5 实验步骤

1. 封闭结束后，用PBS-T液轻轻清洗膜，去除封闭液。

2. 用一抗室温孵育1h或4℃过夜。

3. PBS-T液清洗，10min×3次。

4. 二抗孵育，室温，1h。

5. PBS-T液清洗，10min×3次。

6. 用显色液显色。