DNA实验技术 您的位置：首页 > 实验方法 DNA实验技术

基因芯片技术(三)

点击次数：  更新时间：2018/6/2 14:24:41  

（1）激光扫描荧光显微镜     

      探测装置比较典型。方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5－10μm。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台X－Y方向上步进平移，DNA芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20μm象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。     

  激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人设计的DNA芯片即利用此方法。其方法是将靶 DNA分子溶液放在样品地中，芯片上合成寡核苷酸阵列的一面向下，与样品池溶液直接接触，并与DNA样品杂交。当用激发光照射使荧光标记物产生荧光时，既有芯片上杂交的DNA样品所发出的荧光，也有样品地中DNA所发出的荧光，如何将两者分离开来是一个非常重要的问题。而共焦显微镜具有非常好的纵向分辨率，可以在接受芯片表面荧光信号的同时，避开样品池中荧光信号的影响。一般采用氩离子激光器（488nm）作为激发光源，经物镜聚焦，从芯片背面入射，聚集于芯片与靶分子溶液接触面。杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集，并经滤波片滤波，被冷却的光电倍增管在光子计数的模式下接收。经模数转换反转换为数字信号送微机处理，成像分析。在光电信增管前放置一共焦小孔，用于阻挡大部分激发光焦平面以外的来自样品池的未杂交分子荧光信号，避免其对探测结果的影响。激光器前也放置一个小孔光阑以尽量缩小聚焦点处光斑半径，使之能够只照射在单个探针上。通过计算机控制激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。现在 Affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约 12万美元。