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用 PCR 分析连接反应的底物和产物

点击次数：  更新时间：2018/8/23 13:54:28  

   由 PCR 产生的合成 DNA 文库，可以经过酶切消化，连接到线性化的表达载体系统上。在这里所列的方案中，文库的 5’（NotⅠ）和 3'(ClaⅠ) 末端是不同的酶切位点，也用同样的酶切位点克隆进载体。可以用 PCR 分析线性化反应和连接反应的效率。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

实验步骤：

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

ddH₂O

2. 酶和酶缓冲液

10X Vent 缓冲液

Vent DNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP，各 20 mmol/L

引物，可以与合成的 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火

质粒 DNA(见下面第 1 步）

4. 特殊设备

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭

热循环仪

二、方法

1.混合以下组分。

10~50ng 的质粒 DNA

50pmol 的各引物

5ul 的 10X Vent 缓冲液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

1U 的 Vent DNA 聚合酶

用 ddH₂0 定容至 50ul

下面的每种质粒载体，应该分别进行反应：

未消化载体

消化载体，但没连接

消化载体，并在无文库 DNA 情况下进行连接

消化载体，并用文库 DNA 进行连接

2.在一个热循环仪中，94°C 将混合物预热 20s。

3.按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。

94°C10s

55°C10s(或用引物的合适退火温度）

72°C15s

将最后一个循环的延伸时间延长至 30s

4.冷却至 4°C

5.取 25ul 的各反应产物，跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sam-brook and Russell 2001)。

三、分析

       在图 26-3 所示的例子中，在连接之前进行线性化载体的 PCR 分析，显示载体是完全线性化的，因为没有得到起始载体对应的 PCR 产物（图 26-3, 第 4 泳道）。若不存在文库插入片段，连接载体的 PCR 结果显示发生了一定量的自连（图 26-3, 第 2 泳道），并显示存在一小部分的单切载体。然而，当载体与文库插入片段进行连接后，大部分的 DNA 产物与正确连接的文库 DNA 相对应，而没有与起始载体对应的 PCR 产物（图 26-3, 第 3 泳道）。当载体与插入片段连接后，检测不到起始载体对应的 PCR 产物，但仅用载体连接后能检测到 (比较图 26-3 第 2 泳道和第 3 泳道），可以解释为文库 DNA 连接到了单切的载体上。这一副产物不会形成封闭的环状质粒，不能被克隆，也不会产生 PCR 产物。



       在这个例子中，PCR 作为一种重要的分析工具，能够很可靠地验证限制性酶切反应和连接反应。因此，研究者可以用正确的 DNA 进行文库构建的后续步骤，更可能最终获得高质量的文库。通过转化和扩增细菌，可以获得最终的文库，再用标准的程序对质粒 DNA 进行纯化（Sam brook and Russell 2001)。

本文转载自丁香通