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RNA的光谱分析与定量的过程分享

点击次数：  更新时间：2017/4/20 17:38:49  

我们一般采用分光光度法来进行，主要是针对核酸的精确定量，这种方法的优点在于不但不破坏结构，而且能够回收样品。因为RNA具有吸收紫外光的性质，一般单个核糖核酸在256nm 和 281nm 之间吸收值的平均值为260nm波长，也是吸收的高峰处。

所需的试剂、试剂盒有：DEPC 、无核酸酶的水

所需的仪器、耗材紫有：外分光光度计、石英比色杯

操作的过程，首先我们需要的材料有：紫外分光光度计、石英比色杯、DEPC、无核酸酶的水，然后用用 0.1%DEPC 水浸泡比色皿至少 15 min，用水或无 UV 吸收的缓冲掖设置基线，然后用水或无 UV 吸收的缓冲液稀释 RNA 样品，并进行检测，最后记录样品在波长为 230nm、260nm 和 280nm 处的吸收值，并打印 200～300nm 的扫描曲线。

对于分光光度扫描曲线的分析，有时候我们不是仅仅测定 260nm 和 280mn 的吸收值还需要通过扫描分析而了解污染程度。一般来说，抽提后残留的微量酚、硫氰酸胍的扫描图有明显的差别，A260:A280 的值会有细微差别，m 虽然仍属于可接受的范围，而 RNA 浓度会有显著的改变。由此，当用分光光度法分析 RNA 比值和浓度时，不仅要考虑 280nm,260nm，230nm 的吸收值，而更要在 200～300nm 范围内进行扫描，在抽提 RNA 过程中所用试剂的微量残留物能够影响并误导测定结果, 继而影响后续实验。

对于RNA的定量方面，根裾 RNA 样品在 260mn 处的光吸收值和样品的稀释倍数，我们用紫外分光光度计可以直接测出样品的浓度，也可以按下式汁算：RNA 浓度 (ug/ml)=（A260X 稀释倍数)/(0.024XL) 式中：A260 为 260mn 波长处光吸收值；L 为比色池厚度，一般为 1 cm 或 0.5 cm;0.024 为每毫升溶液内含 1ugRNA 的光吸收值。当比色池厚度为 lcm，样品 A260 为 1 时，RNA 的浓度约为稀释倍数 X40ug/ml。

整个实验做完，有一些需要注意的地方给大家提出来。首先，整个操作过裎中应戴手套，尽量减少外源性 RNase 活性的影响。其次，通常建议用凝胶电泳而不用分光光度法分析 RNA。因为电泳不仅能显示 RNA 的完整性，而且在多数情况下，能显示 RNA 的种类，如原核细胞的 18S/23SrRNA 和真核细胞的 18S/28SRNA。再者，其实根据用 EB 对条带的分析可以大致确定 RNA 的浓度。除此之外，还可以通过荧光染色和 Agilent2100 生物分析仪对 RNA 样品进行。