基因组学 您的位置：首页 > 实验服务 基因组学

DNA片段的亚克隆实验

点击次数：  更新时间：2016/10/12 17:32:46  

DNA片段的亚克隆实验

 

亚克隆:就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。

 

实验材料:DNA

试剂、试剂盒:CIPdNTPDNA聚合酶T4聚合酶DTTATP

仪器、耗材:水浴锅电泳仪培养箱

 

实验步骤

1.  在20 μl 反应体积内用合适的酶完全消化DNA。75℃加热15 min，灭活酶。如若无需进一步的酶促处理，接歩骤6。

 

2.  如果5’磷酸需要去除，加入2 μl 10×CIP缓冲液和1 U CIP，37℃温育30~60 min，75℃加热15 min终止反应。如无进一步的酶促处理，接步骤 6。

 

3.  如果1个或2个末端需变为平端，加入1 μl 含4种dNTP混合液（每种0.5 mmol/l） 和适量klenow酶或T4 DNA聚合酶，温育（见图一），75℃加热15 min 化终止反 应。如果只需1个平端，可用适当的酶消化。如无进一步的酶促处理，接步骤6。

 

4.  若需加人寡核苷酸接头，加入0.1~1.0 μg 的合适的寡核苷酸接头，1 μl 10 mmol/l ATP，1 μl 0.2 mol/l DTT，20~100粘性末端单位的T4 DNA连接酶，15℃过夜， 75℃加热10 min 以终止反应。

 

5.  用识别接头的限制性内切酶切割步骤4的产物。如果两个末端只有一个含有接头，产 物加入另一种酶切割。

 

6.  用琼脂糖凝胶电泳分离所需的片段，在紫外灯下，切下所需条带，纯化DNA。

 

7.  建立以下连接反应

 

（1）9 μl  DNA成分（0.1~5 μg）

 

（2）10 μl  2×链接缓冲液

 

（3）1 μl  10 mmol/l ATP

 

（4）T4 DNA连接酶（20~500粘性末端单位）

 

（5）15℃温育24 h

 

8.  取1~10 μl 连接产物转化感受态大肠杆菌，利用载体上的遗传标记选择重组子。

 

9.  用小量制备法纯化质粒或噬菌体DNA，用限制性内切酶作进一步分析。