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蛋白质定量实验

点击次数：  更新时间：2016/11/19 11:23:48  

 

蛋白质定量实验

蛋白质的量是蛋白质纯化过程中需要检测的一项重要指标，在计算得率或物料平衡或测定目标蛋白质的比活/效价 (potency) 时都要涉及。有各种平台和方法可用于蛋白质定量。这些将会在本书的其他章节进行描述。这一章我们将集中讨论水溶液中蛋白质的分光光度检测，它不需要酶/化学性消化，也不需要在分析前对混合物进行分离操作。

 

试剂、试剂盒： 考马斯亮蓝 G250、乙醇、磷酸

实验步骤

(1) 准备 100~1500 ug/ml 的标准品, 溶于 Bradford 法相兼容缓冲液中。对于较稀的样品，可能通过增加样品在试剂体积中的比率而扩大灵敏度（microBradfordassay:1~25ug/mL)。如果样品与染料的比值太高, 可能会增加反应混合物的 PH 而导致反应背景较高。

 

(2) 将标准品和待测样品加人到一次性的比色皿中 (应该使用一次性的塑料比色皿或微孔板，因为染料会黏附到各种材料容器的表面上）。

 

(3)Bradford 试剂预热至室温。将 ImL 染料溶液加人到 25 uL 蛋白质样品中，混勻，室温孵育 10 min。

 

(4) 检测 450rnn 和 595nm 处的吸光度 (可以使用 570~610nm 的基于滤光器的仪器，对检测性能不会有明显的降低）。

 

(5) 对 595 nm 处的数据作图，或为提高在低反应值处的精度，对 595 nm/450 nm 的比率作图。标准反应曲线可以拟合为一个多项式反应，由此可以估算出待测样品的浓度值.

 

注意事项

Bradford 法的优点有操作方便、灵敏度高和试剂的成本低等。对基于微孔板的检测，试剂的总体积可以减少到 300 由于大多数微孔板分光光度计光源的路径是垂直的，建议使用商业来源的 Bradford 试剂，以减少在长期储存过程中发生的沉淀。

 

我们观察到各种市售的 Bradford 制剂的反应存在着显著的差别（Nobleetal.，2007)。在分析低分子质量的蛋白质或多肽时这种差异更加显著。事实上，据报道，这种方法在应用中存在一个检测分子质量的下限，也就是「阈值」，需要一定数量的特定残基以形成可检测到的信号 (deMorenoetal.，1986)。有报道称，Bradford 试剂成分的改变会引起特定蛋白质反应的改变。因此，当比较不同供应商或不同制剂的 Bradford 数据时应该特别注意（Chanetal.，1995;FriedenauerandBerlet，1989;Lopezetal.，1993;ReadandNorthcote，1981)。

 

Bradford 法对各种试剂的干扰是敏感的，其中包括大多离子去污剂和非离子去污剂，以及糖基化的蛋白质。如果反应混合物发生沉淀，如检测疏水蛋白或膜蛋白时，反应体系中可以添加 5%?10%(V/V) 的 Imol/LNaOH 来助溶。