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融合蛋白的免疫筛选实验

点击次数：  更新时间：2016/11/14 15:47:48  

融合蛋白的免疫筛选实验

 

融合蛋白（fusion protein）有两种不同的含义，一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白，如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一，介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。

 

实验材料:大肠杆菌

试剂、试剂盒:LB顶层琼脂糖叠氮钠第一抗体

仪器、耗材: 硝酸纤维素滤膜

实验步骤

1.  在150 ml LB 平板上滴定λgt11 cDNA文库的滴度，宿主菌为大肠杆菌LE392菌株，每个平板使用7 ml 1%LB顶层琼脂。

 

2.  选择适当的滴度铺平板，于37℃温育8 h。

 

3.  将直径132 mm 硝酸纤维素滤膜分别编号，放入上述已培养8 h的平板中，于37℃温育过夜。

 

4.  用针头刺孔并用印度墨汁在每张滤膜上作一标记，然后取出滤膜。

 

5.  在室温用免疫筛选缓冲液洗膜30 min，以封闭滤膜并洗去膜上的残留细菌，重复洗涤2~4次。

 

6.  将第一抗体（稀释于免疫筛选缓冲液中，终浓度为0.5~10 μg/ml）加到装有滤膜的塑料袋中，热封口后置40℃水平摇床上反应2~24 h。

 

7.  于4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，毎次5~10 min。

 

8.  接着将125I 标记的第二抗体（0.5×106 cpm/ml）加入装有滤膜的热封塑料袋中，4℃反应2~6 h。

 

9.  在4℃用免疫筛选缓冲液洗膜4~5次，然后用滤纸将滤膜上的液体吸干。

 

10.  用塑料保鲜膜包裹好滤膜，使用增感屏在-70℃对X光片曝光。

 

11.  通过反复稀释，纯化λ噬菌体cDNA融合蛋白克隆，最终获得单一的阳性克隆。

 

12.  培养阳性克隆，制备重组λ噬菌体DNA。