实验流程
实验材料:载体酵母 tRNARQ1 DNA 酶糖原小牛肠碱性磷酸酶T4 DNA 连接酶JMJ09 感受态细菌
试剂、试剂盒:PBSNET-2 缓冲液RNase 抑制剂酚氯仿 异戊醇乙酸钠乙醇M-MLV 反转录酶反转录缓冲液通用引物-dN6RNase H电泳缓冲液非变性琼脂糖凝胶上样缓冲液EcoR Ⅰ限制性内切核酸酶EDTA
仪器、耗材: 蛋白 A 琼脂糖凝胶无 RNA 酶离心柱PCR 扩增体系Promega PCR 试剂盒pGEM-7Z 质粒载体 Falcon 2059 聚丙烯管SOC 培养基LB 平板培养基fmol DNA 循环测序系统微型凝胶水平电泳仪紫外透射仪PCR 扩增仪高速低温离心机低温微型离心机台式低温离心机旋转真空浓缩仪
实验步骤
一、材料与设备
1. 细胞提取物的制备
(1) 无菌 1X PBS。
(2) NET-2 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4），150 mmol/L NaCl，0.05% （V / V） NP-40。
(3) RNase 抑制剂。
2. 免疫沉淀
(1) 蛋白 A 琼脂糖凝胶。
(2) 载体酵母 tRNA（1 mg/ml）。
(3) RNase 抑制剂。
(4) NET-2 缓冲液。
(5) RQ1 DNA 酶（Promega 公司）。
(6) 酚：氯仿 ( 1 : 1 )，避光保存。
(7) 氯仿：异戊醇 ( 24：1 )。
(8) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )。
(9) 糖原。
(10) 无水乙醇及 80% 乙醇。
(11) DEPC 处理的水。
3. RNA-rPCR 方法
(1) M-MLV 反转录酶和反转录缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），10 mmol/L DTT，3 mmol/L MgCl2，dNTP ( 每种 0.5 mmol/L），1 U RNase 抑制剂，50 U M-MLV 反转录酶。
(2) 通用引物-dN6：5' -GCCGCTCGAGTGCAGAATTCNNNNNN-3'。
(3) RNase H。
(4) 第二链 cDNA 合成：DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 大片段，10X DNA 聚合酶ⅠKlenow 大片段反应缓冲液，dNTP 混合液（每种 25 mmol/L）。
(5) 酚：氯仿（1 : 1），避光保存。
(6) 氯仿：异戊醇（24 : 1）。
(7) G-50、D-RF 无 RNA 酶离心柱（5-Prime，3-Prime 公司）。
(8) PCR 扩增体系：Taq DNA 聚合酶、10X PCR 缓冲液 [ 100 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.3)，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，0.1% 明胶 ] 、dNTP 混合液（每种 10 mmol/ L）。
(9) 通用引物：5'-GCCGCCGAGTGCAGAATTC-3'。
(10) DEPC 处理的水。
(11) 电泳缓冲液：1X TBE。
(12) 10X 非变性琼脂糖凝胶上样缓冲液：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，15%（m / V）Ficoll 400，溶于去离子水。
4. 构建 cDNA 质粒文库及转化
(1) Promega PCR 试剂盒。
(2) EcoR Ⅰ限制性内切核酸酶。
(3) pGEM-7Z 质粒载体 ( Promega 公司）。
(4) 小牛肠碱性磷酸酶及其 10X 缓冲液。
(5) 0.5 mol/L EDTA。
(6) 酚：氯仿（1 : 1)，避光保存。
(7) 氯仿：异戊醇（24 : 1 )。
(8) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )。
(9) 无水乙醇和 80% 乙醇，-20℃ 储存。
(10) T4 DNA 连接酶及其 10X 缓冲液。
(11) JMJ09 感受态细菌。
(12) Falcon 2059 聚丙烯管。
(13) SOC 培养基。
(14) LB 平板培养基（100 μg/ml 氨苄青霉素）。
5. 克隆筛选
(1) TE 缓冲液：10 mmol/L Tris- HCl ( pH 7.4 )，0.1 mmol/L EDTA。
(2) PCR 反应体系，见3"RNA-rPCR 方法"。
(3) SP6 及 T7 启动子引物。
(4) 酚：氯仿（1 : 1)，避光保存。
(5) 氯仿：异戊醇(24 : 1)。
(6) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2)。
(7) 非变性琼脂糖凝胶。
(8) 电泳缓冲液 1X TBE。
(9) 10X 非变性琼脂糖凝胶上样缓冲液，见3 “RNA-rPCR 方法”。
(10) fmol DNA 循环测序系统（Promega 公司）。
6. 仪器
(1) 微型凝胶水平电泳仪。
(2) 紫外透射仪。
(3) PCR 扩增仪。
(4) 高速低温离心机。
(5) 低温微型离心机。
(6) 台式低温离心机。
(7) 旋转真空浓缩仪（Speed-Vac concentrator）。
二、实验方法
1. 细胞提取物的制备
(1) 培养 3~4 瓶 150 cm2 组织培养瓶的细胞。
(2) 用 10~15 ml 冰冷的 PBS 洗三次。用细胞刮刀收集细胞，用冰冷的 PBS 重悬细胞并将其转移至 50 ml 的无菌离心管中。
(3) 于 4℃ 1000 g 离心 10 min。
(4) 用 0.5 ml 含有 100 U RNase 抑制剂的新鲜配制的 NET-2 缓冲液重悬细胞。
(5) 将细胞重悬液放置冰上超声波处理，每次 5~10 s，共三次。
(6) 将经超声波处理的细胞悬液转移至 15 ml 耐压透性玻璃管中，4℃ 10000 g 离心 10 min，回收上清液，用于免疫沉淀反应。上清液可冻存于 -80°C，但最好立即进行后续的操作。
2. 免疫沉淀
(1) 为从全细胞抽提液中去除同蛋白琼脂糖凝胶非特异件结合的成分，在总细胞蛋白有 1~1.5 mg 的细胞抽提液中加入等体积蛋白 A 琼脂糖凝胶，于 4°C 转动混合处理 30 min。
(2) 4℃ 10000 g 离心 2 min，去除蛋白 A 琼脂糖凝胶，回收上清液待用。
(3) 在处理过的细胞抽提液中加入特异性抗体，40 μl 1 mg/ml 酵母 tRNA 以及 30 μl RNase 抑制剂，于 4℃ 温育 1 h，温育时需轻柔翻转混合。
(4) 加入细胞抽提液 2 倍体积的蛋白 A 琼脂糖凝胶，轻柔混合，于 4℃ 温育 30 min。
(5) 4℃ 10000 g 离心 2~3 min，用 350 μl NET-2 缓冲液洗涤沉淀至少 4~5 次。
(6) 加入 350 μl NET-2 缓冲液及酚：氯仿（1 : 1)，剧烈漩涡振荡 1 min。
(7) 4℃ 10000 g 离心 5 min。
(8) 在水相中加入 10 U RQI DNA 酶，37℃ 温育 15 min，去除污染的 DNA。
(9) 用等体积的酚：氯仿（1：1）进行抽提。
(10) 4°C 10000 g 离心 5 min。
(11) 再用等体积的氯仿：异戊醉（24 : 1 ) 抽提水相。
(12) 4℃ 1000 g 离心 5 min。
(13) 用 0.1 体积的 3 mol/L 乙酸钠、2.5 体积乙醇及 20 μg 糖原沉淀 RNA。糖原有助于沉淀微量的核酸。样品在干冰/乙醇浴至少放置 30 min。
(14) 4°C 10000 g 离心 30 min。
(15) 弃上清液，用 80% 乙醇洗涤沉淀。
(16) 4°C 10000 g 离心 5 min。
(17) 旋转真空浓缩仪浓缩干燥，将沉淀溶于 15~20 μl 水中。RNA 可保存在 -80°C 备用。
3. RNA-rPCR 方法
(1) 取一半通过免疫沉淀制备的 RNA 样品，于 65 ℃ 加热 5 min 后迅速置于冰上冷却。
(2) 将样品进行反转录，总体积为 50 μl，反应体系为：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.3），10 mmol/L DTT，3 mmol/L MgCl2，dNTP ( 每种均为 500 μmol/L)，1 U RNase 抑制剂，50 U MMLV 反转录酶，150 ng 通用引物-dN6 ( 5'-GCCGCTCGAGTGCAGAATTC- NNNNNN-3'）。
(3) 42℃ 温育 1 h，反应结束后于 95 ℃ 加热 3 min，迅速置于冰上冷却。
(4) 加入 1 μl RNase H，于 37℃ 温育 15 min，去除 RNA 链。
(5) 将样品于 95℃ 加热 3 min，置于冰上冷却。
(6) 合成 cDNA 第二条链，在 41.5 μl 第一条链合成反应产物中加入 100 ng 通用引物-dN6（5'-GC- CGCTCGAGTGCAGAATTCNNNNNN-3'），95℃ 加热 3 min，迅速置于冰上冷却。加入 5 μl 10X Klenow 反应缓冲液，1 μl dNTPs ( 每种均为 25 mmol/L)，0.5 μl 100 mmol/L DTT，1 μl（6U） Klenow 酶，终体积为 50 μl。于 37°C 温育 30 min。
(7) 先后用酚：氯仿（1 : 1 ) 及氯仿：异戊醇（24 : 1 ) 抽提样品。再用无 RNase 的 G-50，D-RF 离心柱纯化样品以除去过剩的通用引物-dN6。
(8) 取 1/10 体积的双链 cDNA 为 PCR 扩增模板，然后加入 10X PCR 缓冲液，2.5 μl dNTPs ( 每种 10 mmol/L)，100~200 ng 通用引物（5'-GCCGCTCGAGTGCAGAATTC-3' ) 及 DEPC 处理水至总体积为 50 μl，最后加入 1.5 μl Taq DNA 聚合酶。扩增条件为：94°C 1 min，55℃ 1 min，72℃ 3min，共扩增 40 个循环。
(9) 为保证合成双链 cDNA 的完整性，在 PCR 完成后再追加一个 PCR 反应。在 30 μl 的 PCR 反应液中加入 10X PCR 缓冲液、6 μl dNTP、100 ng 通用引物、3 μl Taq 酶，再加入适量的 DEPC 处理水至终体积为 300 μl。
(10) 轻轻混匀，于 94℃ 30秒，50℃ 1 min，72°C 2 min 的条件下扩增 3 个循环。然后再在 50℃ 1 min，72℃ 5 min 的条件下反应 4 个循环。
(11) 用等体积的酚：氯仿（1: 1) 抽提 PCR 产物，用 30 μl 3 mol/L 乙酸钠及 750 μl 乙醇进行沉淀，将沉淀重悬于 20~30 μl DEPC 水中。
(12) 取 1/10 体积的 PCR 产物进行 1% 非变性琼脂糖凝胶电泳分析。
4. 构建 cDNA 质粒文库及转化
(1) 用 PCR 产物回收试剂盒回收 cDNA，去除剩余的引物。
(2) 用 100 U 的 EcoR Ⅰ消化纯化的扩增 cDNA 产物，终体积为 150 μl，于 37℃ 反应 2 h。
(3) 同时用 10 U 的 EcoR Ⅰ消化 500 ng 质粒 pGEM-7Z，终体积为 10 μl，于 37°C 反应 2 h。然后加入 2 μl 小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）、10 μl 10X CIAP 反应缓冲液，补加 DEPC 处理水至终体积为 100 μl，于 37℃ 温育 30 min。加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA，于 65℃ 保温 20 min 终止反应。
(4) 分别用等体积酚：氯仿（1 : 1) 抽提两种 EcoR Ⅰ消化产物。
(5) 于 4℃ 10000 g 离心 5 min。
(6) 用等体积氯仿：异戊醇（24 : 1 ) 抽提水相。
(7) 于 4℃ 10000 g 离心 5 min。
(8) 于上清中加入 0.1 体积乙酸钠及 2.5 体积乙醇，干冰/乙醇浴中放置 30 min 沉淀 DNA。
(9) 于 4℃ 10000 g 离心 30 min。
(10) 用 1 ml 80% 乙醇洗涤沉淀。
(11) 于 4℃ 10000 g 离心 5 min。
(12) 用旋转真空浓缩仪干燥样品，加 10~12 μl DEPC 处理水溶解沉淀。
(13) 把 1~5 ng EcoR Ⅰ处理的扩增 cDNA 与 100 ng EcoR Ⅰ处理并去磷酸化的 pGEM-7Z 载体用 T4 DNA 连接酶连接，加入 1.5 μl T4 DNA 连接酶及 1.5 μl 10X缓冲液，终体积为 15 μl。
(14) 室温连接 3~3.5 h，样品转化前可保存于 4℃。
(15) 取 5 μl 连接产物加入到 100 μl JM109 感受态细菌中，轻轻混合，冰浴 30 min。
(16) 于 42℃ 热休克 2 min。
(17) 迅速置于冰上 2 min。
(18) 加入 1 ml 预热至 37 ℃ 的 SOC 液体培养基。
(19) 于 37°C，150~200 r/min，振荡培养 1 h。
(20) 取 100 μl 均匀涂于 LB/氨苄平板培养基上。
(21) 37℃ 培养过夜。
5. 克隆筛选
(1) 用 PCR 方法鉴定插入片段的克降。用牙签蘸取每个克隆加入 100 μl TE 中。
(2) 100℃ 加热 10 min。-20℃ 保存模板待用。
(3) 混合 10 μl 模板、10 μl 10X PCR 缓冲液、8 μl dNTP( 每种 10 mmol/L）、100 ng SP6 启动子引物、100 ng T7 启动子引物、1 μl Taq 酶，补充无菌水至终体积为 100 μl。
(4) PCR 扩增，94℃ 40 s，50°C 1 min，72℃ 2 min，共 35 个循环。
(5) 用 1% 非变性琼脂糖凝胶分析 PCR 产物。
(6) 取阳性克隆进行序列分析。
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