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磷酸钙-DNA 共沉淀法

点击次数：  更新时间：2016/12/5 16:26:07  

实验流程

1、配液

 

(1)2×HBS 1.63g NaCl

 

1.19g Hepes

 

0.023g Na2 PO4 、2H2 O

 

加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存

 

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

 

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

 

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

 

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。

 

(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L

 

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

 

2、操作步骤：

 

(1)供体DNA 制备：方法按前介绍的DNA 提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

 

(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2 培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。

 

(3)DNA -磷酸钙沉淀物的制备

 

①将供体细胞DNA 和PSV2-neo质粒载体DNA 用TE配制成40mg/L的DNA 溶液，同时向供体细胞DNA 液200μl中加入带基因neo质粒DNA 液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。

 

②取500μl上述DNA 溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混匀30秒。

 

③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。

 

(4)转染受体细胞

 

①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。

 

②吸取0.5ml DNA -磷酸钙沉淀，加入含5ml培养液的细胞瓶中摇匀。

 

③置37℃ 5% CO2 培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA -磷酸钙结晶颗粒。

 

④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。