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免疫球蛋白标记技术

点击次数：  更新时间：2016/11/8 17:38:43  

免疫球蛋白标记技术

 

免疫标记技术

是用特定的物质标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应。可借助各种仪器观察结果或进行自动化测定，可在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对液体中的抗原、半抗原或抗体进行定性和定量测定。

实验方法原理: 

酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶（如辣根过氧化物酶，简称HRP）国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

实验材料: 抗体

试剂、试剂盒: 戊二醛液、萘氏试剂、PBS、NaIO4、碳酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液、NaBH4

仪器、耗材: 搅拌器、分光光度计、离心机、透析袋、烧杯、试管、吸管

实验步骤

一、酶制剂及其底物

 

凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求

 

1.  来源方便，易于纯化；

 

2.  比活性高，性质稳定；

 

3.  酶活性和量能用简单方法测定。

 

目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶（HRP）和硷性磷酸酶（AP），其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

　　

由于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase， HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18 ％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40000，等电点为PH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58 ％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403 nm和275 nm，一般以OD403 nm /OD275 nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。

　　

HRP的催化反应需要底物过氧化氢（H2O2）和供氢体（DH2）。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反应的过程如下

 

　　　　　　　　　　　　　　　HRP

　　　　　　　　　DH2＋H2O2────→D＋2H2O

　　

供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB（3，3－二氨基联苯胺）的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS（5-氨基水杨酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT（邻联甲苯胺）的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD（邻苯二胺）和TMB（四甲基联苯胺）。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2，2'-边氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。

　　

由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H2O2已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。

 

二、HRP标记抗体的方法

 

酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

　　

1.  戊二醛二步法

 

（1）原理

 

戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

 

（2）标记步骤

 

①称取HRP25 mg溶于1.25 ％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

 

②反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1 ml/1 分钟，收集棕色流出液。如体积大于5 ml，则以PEG浓缩至5 ml。放置25 ml小烧杯中，缓慢搅拌。

 

③将待标记的抗体12.5 mg用生理盐水稀释至5 ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

 

④用1 M PH9.5碳酸缓冲液0.25 ml，继续搅拌3 小时。

 

⑤加0.2 M赖氨酸0.25 ml，混匀后，置室温2 小时。

 

⑥在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4 ℃1 小时。

 

⑦3000 rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15 M PH7.4的PBS中。

 

⑧将上述溶液装入透析袋中，对0.15 M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10000 rpm离心30 分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。

 

（3）结果判定

 

①定性及效价滴定

 

用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法（或在正式实验系统里）对酶结合物进行滴定。

 

②定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定（光程1 cm）。

 

酶量（mg/ml）＝OD403 nm×0.4

 

IgG量（mg/ml）＝OD280 nm-OD403 nm×0.42×0.94×0.62

 

　　　　　   酶量（mg/ml） IgG量（mg/ml） 酶量

克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4

　　　　　　　40000 　　　160000　　　IgG量

 

③本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4 ％的酶与蛋白质结合。

 

2.  简易过碘酸钠法

　　

本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70 ％的HRP和Ig结合，99 ％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。

 

（1）原理

 

经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4（或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记抗体。

　　

（2）标记步骤

 

①称取5 mgHRP溶解于1 ml蒸馏水中。

　　

②于上液中加入0.2 ml新配的0.1 M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20 分钟。

　　

③将上述溶液装入透析袋中，对1 mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4 ℃过夜。

　　

④加20 μl 0.2 M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10 mg IgG（抗体，或SPA5 mg）在1 ml 0.01 M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2 小时。

　　

⑤加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH4液，混匀，再置4 ℃ 2 小时。

　　

⑥将上述液装入透析袋中，对0.15 M PH7.4 PBS透析，4 ℃过夜。

 

其余步骤（纯化）同戊二醛标记步骤的⑥、⑦、⑧。

　　

（3）结果判定

 

除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。

 

IgG量（mg/ml）＝（OD280 nm-OD403 nm×0.3）×0.62

　　

注意事项

1.  在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高，效价高（最低1∶16），纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。

 

2.  所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好（或必需）新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体（杂质）。否则，影响标记效果。

 

3.  室温搅拌时须避光，室内温度一般在25 ℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。

 

4.  浓的标记物相当稳定，常加入30～40 ％甘油于-10 ℃下保存。4 ℃可保存1～2 年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12 小时内用完。切忌反复冻融。

其他

一、工作浓度的选择

　　

在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。

　

1.  酶标记抗体的滴定方法

 

将抗原（或抗体）物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体（或抗Ig抗体）与吸附在载体上的抗原（或抗体）起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。

　　

2.  步骤

 

先将抗原（或抗体）用0.05 M PH9.6包被缓冲液稀释为10 μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1 ml，4 ℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1 ％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600......（根据据抗体的滴度而定），分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1 ml，37 ℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1 ml，37 ℃10～30 分钟。以2 M H2SO4 0.05 ml终止反应。

 

3.  结果判定

 

主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。

 

4.  有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。

 

5.  要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度（可采用方阵法），以达到最适的实验条件。