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实验一 质粒DNA的小量制备

点击次数：  更新时间：2016/11/9 10:16:31  

　　最近在做质粒提取方面的实验，搜集了相关资料与大家分享，这是传统提质粒的方法，与试剂盒提质粒不同，通过这个过程大家可以更好的明白实验原理。

　　1．目的

　　学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。

　　2．原理

　　根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。

　　3．器材

　　超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌器等。

　　4．试剂

　　Pinpoint?xa-3质粒载体菌，pBS-CHI载体菌，LB培养基1000ml（含100μg/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。

　　5．实验准备

　　氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200ml ddH2O 搅拌完全溶解，用约200ml 5N NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1L，121°C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60ml 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd H2O至100ml），75%乙醇（-20°C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /ml RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C 30min）。

　　6．操作步骤

　　（1在超净工作台中取5ml LB（Ampr），加入灭菌的摇菌试管中。

　　（2从超低温冰箱中取出保存Pinpoint?xa-3载体的菌种和pBS-CHI的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100μg/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37°C摇床中摇12~16h。Pinpoint?xa-3菌： 接种于5ml LB（Ampr）； pBS-CHI菌：接种于2ml LB（Ampr）。

　　（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。Pinpoint?xa-3菌：3管（3×1.5ml）； pBS-CHI菌：1管（1.5ml）。

　　（4）在沉淀中加入100μl 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）

　　（5）加入200μl 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

　　（6）加入150μl 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

　　（7）15000rpm离心5min，小心吸取400μl 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800μl 无水乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

　　（8）15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500μl 75%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净。

　　（9）再加入500μl 75% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净。

　　（10）离心管倒置于37°C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。

　　（11）pBS-CHI加入30μl 无菌蒸馏水或TE缓冲液； 3管质粒中每管加入10μl蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在Pinpoint?xa-3质粒中加入1μl RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。

　　（12）清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告。