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琼脂糖凝胶中DNA的回收（DEAE-纤维素膜电泳）

点击次数：  更新时间：2017/1/14 10:38:16  

琼脂糖凝胶中DNA的回收（DEAE-纤维素膜电泳）

实验方法原理 从琼脂糖凝胶回收 DNA 是通过电泳至带正电荷的 DEAE-纤维素膜上完成的。这种方法首先利用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段，然后紧靠目的 DNA 片段条带前方切一裂缝。将一长条 DEAE 纤维素膜插入裂缝。

实验材料 限制性内切核酸酶DNA 样品、DNA标准、RNA

试剂、试剂盒 乙酸铵、DEAE 高盐洗脱缓冲液、DEAE低盐洗脱缓冲液、EDTA乙醇凝胶载样缓冲液、NaOH、酚、氯仿、醋酸钠、TE

仪器、耗材 琼脂糖凝胶、DEAE 纤维素膜、手提式长波紫外灯、水浴

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

 

乙酸铵（10 mol/L)

 

DEAE 高盐洗脱缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1 mol/L NaCI，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)）

 

DEAE 低盐洗脱缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，0.15 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)）

 

EDTA ( 10 mmol/L，pH 8.0)

 

乙醇

 

6X 凝胶载样缓冲液

 

0.5 mol/L NaOH

 

酚: 氯仿（1:1，V/V)

 

醋酸钠（3 mol/L，pH 5.2)

 

TE ( pH 8.0)

 

2. 酶和缓冲液

 

限制性内切核酸酶

 

3. 凝胶

 

琼脂糖凝胶，含有 0.5 μg/ml 的 EB

 

4. 核酸和寡聚核苷酸

 

DNA 样品

 

DNA 标准

 

RNA，酵母转运 tRNA

 

5. 专用设备

 

DEAE 纤维素膜

 

手提式长波紫外灯

 

65℃ 水浴

 

二、方法

 

1. 消化一定量 DNA 以收获至少 100 ng 目的片段 DNA。用含有 0.5 μg/ml EB 的适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段。用手提式长波紫外灯对目的条带进行定位。

 

2. 用锋利的刀片或剃刀在紧靠目的条带前的凝胶上切一切口，其两边比条带宽约 2 mm。

 

3. 戴上手套，切一块与切口等宽而比凝胶稍深（1 mm )  的 DEAE 纤维素膜。在 10 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 室温浸泡 5 min 后，用 0.5 mol/L NaOH 取代 EDTA 浸泡以活化 DEAE 纤维素膜。再次室温 5 min 后，用无菌水冲洗 6 次。

 

4. 用平头镊子将切口壁撑开，将膜插入裂缝中。取出镊子，使切口闭合，小心勿留气泡。

 

5. 继续电泳（<5 V/cm) 直至 DNA 条带迁移到膜上。电泳过程中，可以用手提式长波紫外灯（302 nm ) 进行跟踪检测。

 

6. 当所有目的 DNA 离开凝胶被收集到膜上时，切断电流。用平头镊子从凝胶中取出膜，室温下，用 5~10 ml DEAE 低盐缓冲液将膜漂洗一下，以除去膜上的琼脂糖。

 

7. 将膜转移到另一个微量离心管中，加足量的 DEAE 高盐洗脱缓冲液使膜完全被浸没。轻轻的将膜弄皱或对折，但不要压紧。盖上离心管盖，于 65℃ 温育 30 min。

 

8. 从膜上洗脱 DNA 的过程中，对凝胶成像，记录被分离出的条带。

 

9. 步骤 7 的液体转移到另一微量离心管，再加入足量的 DEAE 高盐洗脱缓冲液，于 65℃ 温育 15 min。合并两份 DEAE 高盐溶液。

 

10. 高盐洗脱液用酚：氯仿抽提一次。水相转移到另一离心管。加入 0.2 倍体积的 10 mol/L 乙酸铵，2 倍体积的 4℃ 乙醇。室温放置 10 min。用微量离心机室温以最大转速离心 10 min。用 70% 乙醇小心洗沉淀。打开离心管几分钟，使乙醇完全挥发。再将 DNA 重溶到 3~5 μl TE (pH 8.0)。

 

11. 如果需要极纯的 DNA ( 如用于小鼠受精卵的显微注射或培养细胞电穿孔)，可以按照下述方法用乙醇再沉淀 DNA。

 

(1) 用 200 μl TE（pH 8.0）悬浮 DNA，加入 25 μl 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2），用 2 倍体积的乙醇重新沉淀 DNA。

 

(2) 4℃ 微量离心机最大速度离心 5~15 min, 回收 DNA。

 

(3) 70% 乙醇小心漂洗沉淀。打开离心管几分钟，使乙醇完全挥发。将 DNA 溶于 3~5 μl TE ( pH 8.0)。

 

12. 通过凝胶电泳对 DNA 进行定性和定量。将少量（10~50 ng) 最终制备的 DNA 片段与 10 μl TE ( pH 8.0) 混合，加入 2 μl 所需的凝胶载样缓冲液。加样并在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，以已知量的经用适当限制酶消化的原 DNA 作为参照物标准和分子质量标准。分离的片段应该与限制酶消化产物中的相应片段同步迁移。仔细检査凝胶，看是否有弱荧光带存在。弱荧光带存在表 明有 DNA 污染。