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初代细胞培养实验

点击次数：  更新时间：2017/1/3 9:58:41  

初代细胞培养实验

 

实验方法原理 合成培养基胰蛋白酶消化培养法，能把组织块分散成细胞团或单个细胞，便于细胞从培养液中摄取营养和排出代谢产物，细胞能较快地长成单层。

 

本法尤适用于培养大量组织，细胞产量高；但用于经常性小量培养工作稍显繁琐，无菌操作不良时且易污染。

实验材料 组织

试剂、试剂盒 Hanks、培养液、胰蛋白酶

仪器、耗材 吸管、平皿、培养瓶、烧杯、搅拌器、三角烧瓶、不锈钢筛、眼科剪、眼科镊、计数板

实验步骤

1.  准备

 

取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20 分钟；

 

2.  布局

 

点燃酒精灯（或煤气灯），安装吸管帽（应通过火焰）；

 

3.  处理组织

 

把组织块置入烧杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60 分钟；

 

4.  剪切

 

用眼科剪把组织块切成2~3 毫米大小的块（用手术刀割亦可），以便于消化；加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞；

 

5.  消化

 

或用恒温水浴，或置入37 ℃温箱消化均可，消化中每隔20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好（消化前瓶中需置一无菌搅棒）；消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定；

 

6.  分离

 

在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块（必要时可继续进行消化）；低速（500~1000 转/分）离心消化液5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脱一两次后，再加入培养液）；

 

7.  计数

 

用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中；对大多数细胞来说，pH 要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说胆液体变酸，可用NaHCO3调整；

 

8.  培养

 

置入36.5 ℃温箱培养；如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需更换新塞。