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如何用免疫荧光技术征服萌妹子

点击次数：  更新时间：2017/10/12 13:51:18  

一. 免疫荧光简介

免疫荧光（immunofluorescence）技术是在免疫学，生物化学和显微技术的基础上建立的一项技术，再用荧光抗体（或者）抗原作为探针检测细胞或组织内相应的抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光在细胞或者组织的表达，从而确认抗原或抗体的性质和定位。常用的方法有直接法和间接法。

二.实验步骤

1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞，固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月；

3、通透。目的：以保证抗体能够到达抗原部位。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。

透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.

4、封闭。为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用0.5%BSA或血清（与二抗来源一致 如 一抗为兔抗，二抗为山羊抗兔，那么封闭液就用山羊血清）封闭，减弱背景着色。

血清封闭的时间是可以调整的，一般为30min。

5、一抗结合。吸净山羊血清，室温孵育1h或者4℃过夜。

（实拍图，请勿盗用）

6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

三.注意事项

1、经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

2、二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。　

3、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

4、要单独冲洗，防止交叉反应造成污染；要温柔冲洗，防止切片的脱落；冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

5、加入荧光抗体后一定要记得避光！！！每次试验时 ，建议设置以下三种对照：

阳性对照：阳性血清+荧光标记物

阴性对照：阴性血清+荧光标记物

荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。　

7、细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可，之后片子可保留更长时间。

四.主要应用

免疫荧光技术应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。