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这里有一套荧光定量 PCR的独家秘方PCR

点击次数：  更新时间：2017/10/13 9:18:31  

提取RNA原理

原理：

1.细胞在Trizol的作用下迅速破裂，样品匀浆化，使细胞内含物被溶解的同时，其中的RNA酶抑制剂能够保持RNA的完整性；

2.利用氯仿进行变性蛋白-抽提苯酚-分层（水相-蛋白质中间层-有机相）、乙醇沉淀RNA、吸附柱吸附分离RNA、Buffer缓冲液洗涤RNA。

操作步骤：

关键点：

样品细胞或组织的有效破碎，即裂解完全；

加入氯仿后，剧烈震荡充分；

对RNA酶的抑制；

提取RNA时，全程使用冰盒，RNA/miRNA保存于低温，最好-80℃,否则容易降解；

实验所用试剂均在有效期或反应成分仍有效（试剂盒、氯仿等）。

测定浓度纯度操作

1.UV-1600PC紫外分光光度计开机预热20min；

2.设定紫外波长 260nm，用ddH2O洗涤比色皿，向比色皿中加入 50ul ddH2O，放入样品室的S池架上，校零；

3.将待测样品稀释（RNA 5ul用ddH2O稀释至50μl）混匀后，记录编号和稀释倍数；

4.把混匀的待测样品移入干净的比色皿中，放进样品室的S架上，记录稳定的OD260(A260)的值；

5.以同样的方式测待测样品在280nm下的OD值；

6.计算待测样品的浓度与纯度:

RNA样品的浓度（ng/μl）=OD260×稀释倍数×40;

纯度=OD260/OD280

举例

某客户某一组样品RNA测得OD260=1.016Abs，OD280=0.533Abs，根据计算公式可得：RNA浓度  1.016×40×10=406.4 ng/ul；RNA纯度  1.016/0.533=1.906此浓度和纯度均适合做PCR。

问题分析

(1)蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。

(2)苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。

(3)多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。

(4)设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间，此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10 mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。

3

合成cDNA

将 RNA 模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、5xRT Buffer、HiFiScript 和 RNase-Free Water 溶解并置于冰盒上备用。

根据以下表格配制反应体系，总体积为20ul.

 

70℃孵育 10min，迅速冰浴 2min。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。继续向以上反应液中加入以下试剂：

50℃孵育15min，85℃孵育 5min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。

逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，加入量小于PCR反应体系的1/10,或置于-20℃长期保存。 

注意事项：

1.加入各种逆转录试剂及RNA时，在冰盒上操作，以防RNA降解；

2.加入试剂后，分别进行各阶段的水浴，确保温度、时间，已便于酶促反应完全。

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PCR

PCR由模板DNA的变性→模板DNA与引物的退火→引物的延伸三个基本反应步骤构成

根据实验要求，从NCBI库中查找相应引物的基因序列，利用primer premier5软件查找出引物序列，按照设计原则，择优而选。

操作体系：

（1）配制成25ulPCR反应体系如下：

（2）PCR扩增条件：设置梯度退火温度查找

PCR主要影响因素：（1）RNA浓度、纯度（2）退火温度的设置（3）引物设计