一、DNA目的片段的扩增

反应体系：

加适量石蜡油，扩增反应在PTC-220 Tetrad Thermal Cycler (MJ Research)上进行。

PCR反应程序：

*：PCR退火温度由引物序列（GC含量）决定。

（1）1g的琼脂糖倒入装有100mL NEB的三角瓶中。（一般0.2g琼脂糖加20ml水可以倒1/4面平板）

（2）微波炉加热至澄清无气泡，稍微冷却加1-2滴EB染色液；

（3）将胶倒入装置好的电泳托盘中，冷凝后放入电泳槽。

（4）点样，90V-120V，20min左右。

（5）电泳结束后置于凝胶成像仪下观察拍照。

（1）在紫外灯下切下含目的DNA的琼脂糖胶块，放入1.5mL的管中。

（2）按每100mg琼脂糖加入300μL DE-A液（溶胶液）的比例加DE-A液，置75℃ 6~8min，每2min颠倒一次离心管，直至胶块完全溶化（当目的片段小于400bp时，加入1/3 DE-A体积异丙醇。当目的片段大于400bp时，可省略此步骤）。

（3）加入1/2 DE-A体积的DE-B溶液，混合后转入吸附柱，12000g离心30s，倒去下管中的液体。

（4）在吸附柱中加入500μL W1液（洗涤液），12000g离心30s，倒去下管的液体。

（5）再在吸附柱中加入700μL W2液，静置1min，12 000g离心30s，倒去下管中的液体。重复一次。

（6）12000g离心1min。

（7）将吸附柱取出放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入20μL TE，静置1min后（或稍长），12000g离心1min。

（8）弃去吸附柱，将含回收产物DNA的1.5mL离心管贮存于-20℃。

*注意：1）于16℃下连接8h，如有必要可以过夜连接；2）此处看回收纯化产物的浓度来调节ddH2O的用量，总量5μL

随机挑取白色菌落于含有200ml LB液体培养基（含相应抗生素）的0.5mL离心管中，37℃、225r/min摇动培养3~4小时后，用特异引物进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，鉴别出有正确插入片段的阳性重组克隆，送样测序

注：此处注意加相关对照，一般采用相同的片段大小来鉴定挑取的单克隆是否为目的基因。