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流式细胞术达人来报到，通关秘籍看这里！

点击次数：  更新时间：2017/10/16 9:30:01  

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 

一. 流式细胞术的特点

流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。

[细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量]

二.流式细胞术之免疫检测样品制备

1、外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

a．取人外周血5mL，肝素抗凝，用等量hanks缓冲液或者RPMI 1640稀释成10mL,混匀；

b. 淋巴细胞分离液10mL加入离心管中，轻轻将稀释后的外周血加入到淋巴细胞分离液液面上，保持清晰分层状态。

c.室温下400g离心30min。

d.离心完后可以见到离心管内的血液分为清晰的四层，上层为血浆层，可以取来做ELISA。中间层为分离液层。在上中层界面处有一个以单个核细胞为主的灰白色云雾带，即为淋巴细胞和单核细胞，还包括血小板。底层为红细胞。

e.吸出中间层单个核细胞，如有红细胞污染稍微破红即可。

2、培养细胞的样品制备：

蛋白酶消化→机械吹打→使贴壁细胞脱落→洗涤      尼龙网过滤

3、新鲜实体组织单细胞悬液的制备

机械法

a. 用剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织；

b. 将剪碎的组织加入匀浆器中匀浆；

c. 用吸管或注射器抽吸细胞悬液，以分散细胞；

将细胞悬液在尼龙网或不锈钢网上过滤，滤出的细胞悬液细胞计数后即可使用。

酶处理法

这里中洪博元小编仅介绍组织消化的一般过程，对于每种组织消化时所用的具体步骤需参考该组织细胞培养时的消化方法。

a. 将组织剪成l～2mm3左右的小块。

b. 用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0.1％～0.5％。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25％胶原酶，胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0.1～0.3ug／m1。用大于组织量30～50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织，需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶需作用20～60分钟，胶原酶需4～48小时。在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。

c. 消化完毕后，将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的组织。

d. 已过滤的细胞悬液经800～1000rpm低速离心5～10分钟后，弃上清液，加PBS液，轻轻吹打形成细胞悬液，细胞计数后即可使用。

化学试剂处理法

表面活性剂处理法

4、单细胞悬液的保存

深低温保存法（一年）

乙醇或甲醇保存法（2周）

甲醛或多聚甲醛保存法（2月）

三.常用的荧光染料与标记染色

1、几种常见的荧光染料

2、免疫荧光标记方法

直标：干扰少,但需购买多种单抗

间标：步骤多,干扰多,不需标记多种抗体

组合标记

四. 流常见问题及解答

五. 在免疫学检验中的应用

流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面。

1、淋巴细胞及其亚群的分析

T淋巴细胞及其亚群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)

B淋巴细胞及其亚群分析

B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关

B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体

NK细胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)

2、淋巴细胞功能分析

细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例)

细胞内细胞因子测定

3、淋巴造血系统及白血病免疫分型

对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型

用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变

4、肿瘤耐药基因分析：MDR(+)表示对化疗药物耐药

5、AIDS病检测中的应用：CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例

6、自身免疫病相关HLA抗原分析：HLA-B27可出现在58%～97%的强直性脊椎炎(As) 患者

7、移植免疫中的应用

FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（Flow cytometry cross-matching, FCXM）和群体反应性抗体（Panel reactive antibody, PRA）检测。