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颅脑创伤后循环血中脑源性微粒的研究

点击次数：  更新时间：2017/10/23 9:13:36  

自从CT发明以来，脑外伤救治已取得了非常大的突破和进展，但进入21世纪以后，走向了平台期。目前比较多的讨论和研究集中在手术去大骨瓣是否有效、颅压监护是否有用、神经营养药是否有用等，然而并没有得出一致的结论。我认为，在脑外伤领域如果还要取得突破性进展，进一步降低死亡率，就必须重视基础研究。从临床提出问题，以基础研究为平台，突破基础理论和机理上的瓶颈，创新治疗思路，找出治疗办法。近期我们对脑创伤后的脑源性微粒（brain-derived microparticles，BDMP）进行了研究，取得了令人振奋的效果，将来有可能产生一些突破。现报道如下。

 

一、血中的微观世界

 

事实上，我们的血液中并不那么“干净”。除了人们所熟知的红细胞、白细胞和血小板之外，还包含许多更小的有形成分，其构成复杂、种类繁多，人们按其直径大小分为以下3类进行研究：凋亡小体直径约1~5μm，与血小板大小一致；再小一级是微粒（microparticles，MPs），直径约0.1~1μm，与细菌大小一致；最小的是外泌体，直径约30~100nm，与病毒大小一致。它们都具有极其重要的生物学功能。例如血液中单独存在的裸露mRNA会很快被酶切而失去生物活性，但是如果有MPs或者外泌体，就会成为一个很好的载体并作为相应的归巢定位去发挥它的生物功能。这些成分是如何产生的呢？有些是由凋亡产生，例如创伤可以导致细胞凋亡，产生凋亡小体；有些是在细胞受到刺激以后释放的，如MPs；还有一些是细胞主动分泌的，如外泌体。

 

二、BDMP：MP的新成员

 

研究提示，神经元和胶质细胞损伤后可以释放MPs。因为线粒体在细胞生物学功能上有很重要的作用，且线粒体标记具有特异性，所以我们将线粒体微粒（mitochondria microparticles，mtMPs）作为观察对象。研究发现，无论是神经元还是胶质细胞，在损伤以后都可以释放出mtMPs。通过流式细胞术可以在细胞培养的上清液中检测到mtMPs的释放。mtMPs中含有线粒体的DNA，还可以检测到一些mRNA及相应的酶。这些测定结果为研究mtMPs的生物学功能打开了遐想的空间。作为神经外科学者，我们的研究集中在对颅脑创伤后BDMP的观察。我们团队在国际上首先报道在脑组织和循环血液中可以观察到BDMP。在透射电镜下，可观察到BDMP具有膜结构、线粒体、内质网等；通过流式细胞技术，可观察到BDMP中含有丰富的磷脂以及一些脑组织特异性的蛋白，且都具有相应的生物学功能。

 

磷钨酸负染色之后，发现其表面的磷脂膜中存在膜蛋白。我们还研究了BDMP的生物学功能。把BDMP注入小鼠体内后，会导致小鼠死亡，逐渐降低剂量之后，可以摸索出一个剂量非常微小的半数致死量。然后对BDMP表面进行处理，在不破坏BDMP整体结构的情况下用酶将其表面的蛋白消化掉，再次注入小鼠体内后则不会出现小鼠死亡。研究还发现，将同样浓度的BDMP打碎成为磷脂和蛋白质后注入小鼠体内，小鼠也未出现死亡。这些现象说明，BDMP有赖于其结构的完整性和表面的膜蛋白去发挥作用。我们发现，BDMP可激活血脑屏障上的某些细胞，使细胞之间的缝隙连接开放，血脑屏障打开。我们最近观察了周细胞，发现受BDMP刺激以后，原本扁平状态的周细胞会揪起来，高度增加，缝隙开放。说明BDMP很有可能在创伤后的脑水肿中具有很重要的作用。

 

三、颅脑创伤后BDMP的作用机制

 

（一）脑内作用

 

中枢神经系统在受到外伤后，不论是神经元还是胶质细胞受损，都可以释放出BDMPs。BDMPs首先在脑内局部起作用，其作用可能有两个方面：（1）保护作用。有一些主动分泌的外泌体，可以促进轴索和神经元的修复；（2）损伤作用。有些MP被释放后，其生物学功能会激活，对神经细胞产生一定的损伤。而且，BDMP还可以刺激周细胞和内皮细胞，促使血脑屏障打开从而进入循环血。在循环血中能够激活血小板、刺激白细胞并产生相关反应。这些反应对脑外伤后的病理生理机制产生极其重要的作用。

 

（二）MP与凝血功能障碍的关系

 

脑外伤后患者常合并凝血功能障碍，其可导致或加重脑外伤后脑水肿、颅内出血、脑梗塞等一系列继发性脑损害。而且创伤后出现不能控制的自发性出血，也是导致创伤患者死亡的一个主要原因，占创伤患者人数的30%~40%。文献报道脑外伤的凝血障碍发生率为10%~87.5%不等。周良辅教授报道有超过50%的重型脑创伤患者会伴发凝血功能障碍。凝血功能障碍的发生与损伤严重程度相关，它还是脑创伤后死亡的一个独立影响因素。凝血功能障碍的发生与MP是否有关系呢？研究发现BDMP可与血小板结合，在荧光显微镜下首先表现为膜与膜可以碰到一起；其次发现两者可以融合，一些是MP完整地被血小板吞噬，另一些是融合后将内容物释放到血小板里。流式细胞术也证实了上述改变，这种改变会导致血小板被激活。

 

实验显示，BDMP的促凝活性强度和组织因子一样。组织因子等因素通过内源性机制可导致血小板激活，血小板的激活分为两个阶段。首先血小板活化，然后通过血小板上的蛋白结构来抓取周围的红细胞等，从而形成血块、血栓。但研究发现，虽然BDMP可以激活血小板，但却只激活第一阶段，即被BDMP激活后的血小板处于一种高能状态，却并不直接将红细胞等聚合在一起形成血块。

 

此时如果出现其他继发性损害，如手术时间过长或肺部感染，就很可能会马上出现大量的微血栓及弥散性血管内凝血。手术过程中，我们不难发现有些重伤患者的血液和正常血液是完全不一样的，表现为血液流出后基本不会凝固，这很可能就是BDMP的作用。因为它会消耗大量的纤维蛋白原，使血小板处于高水平激活状态，一旦出现继发性损害，就会形成微血栓。脑外伤以后，血液中有内皮细胞、血小板、白细胞等来源的MP，BDMP只占了一部分。相比MP的总量来讲，BDMP的数量很小，但它的作用却可能很大。经血液测定，神经胶质纤维酸性蛋白阳性的MP在外伤后3h出现高峰，神经元特异性烯醇化酶阳性的MP则在外伤1h后即出现高峰。BDMP可以导致凝血时间的改变，将BDMP去除之后，其上清液就不会引起这样的改变。循环血中BDMP含量改变的结果是什么呢？随着凝血机制被激活，体内纤维蛋白原会被大量消耗形成纤维蛋白，覆盖在血小板的表面，再结合红细胞等形成血栓。

 

所以外伤后，血中的纤维蛋白原一般是呈降低状态的，凝血时间是延长的。这就是MP的作用之一。当这一过程完成后，纤维蛋白会沉积到肺、肾脏、心肌等部位，其具体代谢途径我们以后还会深入研究。

 

总结以上，我们的研究可以证实以下几点：（1）外伤后损伤的神经细胞可产生BDMP；（2）BDMP在体外和体内均具有高度的促凝活性；（3）创伤后的BDMP可以穿透血脑屏障进入循环血中，导致血小板激活等系列变化；（4）BDMP与TBI后凝血功能障碍的发生和发展关系密切。

 

（三）颅脑损伤后的免疫反应

 

以前中枢神经系统一直被认为是免疫豁免器官，但现在则认为，中枢神经系统也并非排除在免疫调控作用之外。已有研究发现在颅内矢状窦附近存在淋巴管结构。颅脑创伤后免疫炎症反应通过引起的血脑屏障破坏可致大量脑组织碎片及细胞颗粒释放入血，同时外周循环系统免疫炎性细胞亦可浸润脑组织引起局部免疫反应，直接损伤神经元细胞，导致继发性损伤。颅脑损伤既可以使血脑屏障发生改变，又使单核-巨噬细胞及小胶质细胞的“清道夫”作用泛化，减弱其识别“自我”的能力，导致损伤区脑组织产生相应的病理变化。颅脑损伤后免疫炎症反应贯穿继发性脑损伤的全过程，由MP介导的免疫炎症反应机制逐渐受到广泛关注，并被证实与多种免疫炎性疾病发生有关。

 

重型颅脑损伤患者外周血和脑脊液中不仅血小板来源的MP显著增高，且内皮细胞和白细胞来源的MP数量也显著增高。MP本身可以携带多种促炎物质，当MP被免疫细胞吞噬或与免疫细胞结合时，则会改变靶细胞的生物活性。这些改变很可能为我们进一步研究颅脑创伤打开一个新的窗口。因心磷脂只存在于线粒体中，我们以心磷脂抗体为标记进行研究，通过检测心磷脂阳性的微粒，可以发现小鼠颅脑创伤后会有心磷脂抗体的产生，且具有其特异性及其相应的功能。以抗脑抗体为例，我们对小鼠创伤性脑损伤后抗脑自身抗体进行检测。通过ELISA法检测，发现小鼠伤后14d血浆中抗脑抗体的含量在逐渐增高，说明其在继发性损伤当中，免疫炎症反应是参与作用的。颅脑损伤后损伤的神经元及胶质细胞碎片以BDMP形式释放并进入外周血。

 

除细胞膜MP外，细胞器也可以从损伤的细胞中释放出来。在颅脑损伤的急性期外周血中可检测到完整或部分破坏的脑源性mtMP，其占BDMP的比例超过50%。有理由认为BDMP是导致颅脑损伤后免疫炎症反应异常和凝血功能障碍发生的关键环节。

 

四、颅脑创伤后BDMP研究的展望

 

颅脑损伤后损伤的神经细胞可产生BDMP，其具有高度的促凝活性及潜在的促炎活性，导致损伤后凝血功能障碍。BDMP是介导免疫炎症反应异常和凝血功能障碍这两个相互重叠的病例变化的重要介质之一，TBI后免疫炎症反应异常和凝血功能障碍关系密切，它们是TBI患者预后不良及致残的重要原因之一。

 

MP在人体内的清除半衰期为5h，但其清除机制仍不清楚。MP可能成为揭示TBI发生发展机制、探索TBI治疗的新靶标。我们做了一些研究，发现一种蛋白可以在体外阻断MP的作用，注入体内后，观察到外伤后脑水肿出现减少。将该蛋白注入小鼠体内后，再注入致死量的MP后发现，小鼠却并未出现死亡。通过对该现象的深入研究，将来是否可以开发出一种新型早期干预治疗的手段？另外，外伤后局部高浓度的BDMP也有可能是把双刃剑。在其引起血脑屏障损伤的同时，如果通过更加精细深入的划分，发现比外泌体更小的成分，或许可以促进外伤后半暗带区神经组织的修复以及神经损伤区血管单元的再建立。研究提示，颅脑创伤后血液中的许多MP会聚集到外伤损伤区，其进一步发生机制如何，信号传导通路是怎样的，是否可通过基因修饰或MP干预来阻断或增强其相关变化？这将很有可能为颅脑创伤治疗开辟一条新途径。

 

（本文转载中华神经创伤外科电子杂志2017年4月第3卷第2期）