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献给初学者，PCR技术你知多少

点击次数：  更新时间：2017/10/23 10:37:13  

PCR简介

荧光定量PCR：指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

反应步骤

 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成

（1）模板DNA的变性

（2）模板DNA与引物的退火

（3）引物的延伸

引物设计

根据实验要求，从NCBI库中查找相应引物的基因序列。利用primer premier5软件查找出引物序列，按照设计原则，择优而选。

以小鼠的IL-10基因序列为例：

操作体系

（1）配制成25ulPCR反应体系如下：

（2）PCR扩增条件：设置梯度退火温度查找

PCR主要影响因素

（1）RNA浓度、纯度；（2）退火温度的设置；（3）引物设计。