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粘附实验教程来一波，你掌握了吗？

点击次数：  更新时间：2017/11/11 14:49:57  

细胞粘附分子(cell adhesion molecules，CAMs) 是一类膜表面糖蛋白，它们以配体－受体特异性结合的方式介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的相互接触和结合并调节细胞功能，在胚胎发育和分化、正常组织结构的维持、炎症反应、免疫应答、凝血和血栓形成、创伤修复、肿瘤浸润与转移等许多生理和病理过程中发挥重要的生物学作用。层粘连蛋白LN和层粘连蛋白FN是常用的用于细胞粘附能力检测两种蛋白，多数肿瘤细胞对于上述蛋白具有较强的粘附能力，以LN或FN蛋白预先包被96孔板，按照实验设计将一定量的细胞铺至孔底部，继续培养细胞至实验设定时间，取出培养板，洗去未粘附至孔底的细胞，剩余细胞行进行苏木素或结晶紫染色，以酶标仪测定各孔读数，读数高低与细胞粘附能力成正比。本实验主要用于判定细胞在经过各种药物处理、基因转染、敲除或培养条件改变后，细胞的粘附能力改变情况。

一. 实验材料及试剂

96孔培养板、倒置显微镜、酒精灯、移液枪、CO2培养箱、酶联仪等；As2O3、FN、MTT等。

二、实验内容

取70μg/ml的FN包装96孔板，每孔30μl，在超净台风干后放入4℃冰箱中备用。实验时取1×106/ml的细胞接种于已包被FN的96孔培养板中，每孔100μl，设4复孔，待细胞贴壁后(4～5h)，加入浓度分别为2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml的As2O3注射液100μl，对照加入100μl培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱内分别孵育20、40、60、120min，吸出培养液，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4h，弃去全部上清，每孔加入100μl  0.04mol/L盐酸异丙醇，微型振荡器振荡5～10min，使结晶完全溶解，在酶联仪波长570nm处测出各孔吸光度值(OD)，以OD值代表黏附细胞数，按下列公式计算细胞黏附抑制率:抑制率(%)=〔1-(加药孔平均OD值-空白孔平均OD值)/对照孔平均OD值-空白孔平均OD值)〕× 100%。

        

三、注意事项

1、细胞浓度或细胞数。

2、粘附时间多长时间。

3、粘附后方法的选择：即选用什么方法来确定细胞粘附效果，有染色，显微镜计数，荧光分析等。